Manual de laboratorio para Drosophila Melanogaster, Guías, Proyectos, Investigaciones de Genética

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MANUAL DE LABORATORIO DE

GENÉTICA

PARA

Drosophila melanogaster

REGISTRADO

Patricia Ramos Morales (Coordinadora del proyecto)

Héctor M. Abundis Manzano (Fotog

Juan Carlos Gaytán Oyarzun

Ma. Guadalupe Ordaz Téllez

Patricia G. Orozco Soto Julián

Maldonado Luis (Dibujo)

Judith Hernández Aranda

Edna González César Pedro

Reyes Martínez Enriqueta M.

Galicia Mendiet J. Armando

Muñoz Moya

Revisión técnica: Dra. Rosario Rodríguez-Arnaiz Doctora en Ciencias (Biología) Profesora Titular de Genética, UNA Coordinadora del Laboratorio de Gen Facultad de Ciencias, UNAM

McGRA

MÉXICO • BUENOS AIRES • CARACAS • GUATEMALA • LISBOA • MADRID • NUEVA YORK PANAMÁ • SAN JUAN • SANTAFÉ DE BOGOTÁ • SANTIAGO • SAO PAULO AUCKLAN • HAMBURGO • LONDRES • MILÁN • MONTREAL • NUEVA DELHI • PARÍS SAN FRANCISCO • SINGAPUR • ST. LOUIS • SIDNEY • TOKIO • TORONTO

Gerente de producto: Alejandra Martínez Avila Supervisor de edición: Armando Castañeda González Supervisor de producción: Zeferino García García

MANUAL DE LABORATORIO DE GENÉTICA PARA Drosophila melanogaster Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin autorización escrita del editor.

DERECHOS RESERVADOS © 1993, respecto a la primera edición por McGRAW-HILL INTERAMERICANA DE MÉXICO, S.A. de C.V. Atlacomuleo 499-501, Fracc. Ind. San Andrés Atoto, 53500 Nauealpan de Juárez, Edo. de México Miembro de la Cámara Nacional de la Industria Editorial, Reg. Núm. 1890

ISBN 978-970-10-0222-

1234567890 PE 93 9087654123

Impreso en México Printed in México

Esta obra se terminó de Imprimir en marzo de 1993 en Programas Educativos, S.A. de C.V. Calz. Chabacano Núm. 65-A Col. Asturias Deleg. Cuauhtémoc 06850 México, D.F. Se tiraron 3600 ejemplares

Contenido

• Introducción
• CAPÍTULO I. Generalidades - Hábitat
  • Ciclo de vida - Huevo - Larva................................................................................................................................. - Pupa - Adulto...............................................................................................................................
  • Morfología externa del adulto................................................................................................ - Cabeza - Tórax - Abdomen
  • Gametogénesis - Ovogénesis....................................................................................................................... - Espermatogénesis
  • Referencias..............................................................................................................................
• CAPÍTULO II. Técnicas de manejo de laboratorio
  • Captura
  • Medio de cultivo
    • Reconocimiento fenotípico del sexo
    • Obtención de hembras vírgenes............................................................................................. - Colecta de hembras vírgenes a partir de imagos - Colecta de hembras vírgenes a partir de pupas - Colecta de hembras vírgenes a partir de larvas de tercer estadio.................................
    • Manejo de las moscas - Elaboración del eterizador
    • Observación de moscas adultas..............................................................................................
    • Control de plagas....................................................................................................................
    • Propagación de líneas de Drosophila
    • Cruzas experimentales entre moscas que pertenecen a líneas diferentes.............................
    • Cuestionario
    • Referencias
    • Lecturas sugeridas
  • Práctica 1: Nomenclatura y simbología viii CONTENIDO
  • Práctica 2: Cruzas monohíbrida y dihíbrida
  • Práctica 3: Genes letales
  • Práctica 4: Interacción génica
  • Práctica 5: Epistasis..........................................................................................................
  • Práctica 6: Herencia ligada al sexo...................................................................................
  • Práctica 7: Mapeo genético
  • Práctica 8: Genética del desarrollo
  • Práctica 9: Penetrancia y expresividad.............................................................................
    • Práctica 10: Fenocopias
    • Práctica 11: Caracterización cromatográfíca de mutantes de Drosophila.......................
    • Práctica 12: Cromosomas politénicos.................................................................................
    • Práctica 13: Herencia extracromosómica
    • Práctica 14: Detección de genes letales dominantes...........................................................
    • Práctica 15: Interacción entre dos especies (ecología)
    • Práctica 16: Genética de poblaciones..................................................................................
• Apéndice 1: Probabilidad y estadística......................................................................................
• Apéndice 2: Marcadores genéticos de Drosophila melanogaster..............................................
• Glosario

Datos curriculares de los autores

Patricia Ramos Morales: Bióloga, Maestra en Ciencias, Profesora Asociada de Tiempo Completo Definitivo del Laboratorio de Genética y Profesora Titular de la materia de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Héctor M. Abundis Manzano: Profesor de Laboratorio y de la materia de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Juan Carlos Gaytán Oyarzun: Biólogo, Profesor de Laboratorio y de la materia de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Ma. Guadalupe Ordaz Téllez: Bióloga, Profesora de Laboratorio y de la materia de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Patricia G. Orozco Soto: Bióloga, Profesora de Laboratorio de Genética, Profesora Titular de la materia de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Julián Maldonado Luis: Becario en el Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Judith Hernández Aranda: Profesora de Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Edna González César: Tesista de la Licenciatura en Biología, Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Pedro Reyes Martínez: Prestador de Servicio Social de la Licenciatura en Biología, Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Enriqueta M. Galicia Mendieta: Profesora de Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

J. Armando Muñoz Moya: Tesista de la Licenciatura en Biología, Laboratorio de Genética, Facultad de Ciencias, UNAM.

Capítulo I

Generalidades

La mosca de la fruta es un insecto que pertenece al orden Díptera que agrupa a aquellos organismos en los que sólo el primer par de alas es funcional y el segundo se ha transformado en órganos del equilibrio, los llamados halterios o balancines. Es un organismo representativo de la familia Droso- philoidae la que incluye a mosquitas pequeñas, con algunas cerdas y venación de las alas carac- terística; el género Drosophila comprende varias especies de moscas con la vena subcostal de- generada, incompleta o ausente; las pertenecientes a la especie melanogaster (1830, Meigen) tienen dos interrupciones en la vena costal.

HÁBITAT

Las especies de Drosophila son cosmopolitas, es decir, están ampliamente distribuidas, por lo que se les encuentra en todo tipo de clima, altitud y latitud; se localizan especialmente en las frutas suaves donde la fermentación se ha iniciado y en general en alimentos con alto contenido de ácido acético.

CICLO DE VIDA

El desarrollo de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster presenta un periodo de embriogénesis dentro del huevo y una sucesión de estadios larvales que culminan con una metamorfosis completa (holometábola), de la que finalmente surge un imago o adulto (Fig. 1). La secuencia y duración de los diferentes estadios en el ciclo de vida son: huevo, un día; larva de primer estadio, un día; de segundo, un día, y de tercero, un día; pupa, 4.5 a 5 días. Así, la duración del ciclo de vida completo es de 9.5 a 10 días en condiciones controladas de temperatura y humedad relativa, 25°C y 60%, respectivamente. Los cambios en la temperatura afectan la duración del ciclo de vida, por ejemplo, a 10°C el estadio larvario requiere unos 57 días, mientras que a 27°C el ciclo completo toma 9.5 días. Los valores entre 27 y 30°C ocasionan esterilidad en las moscas y reducen la viabilidad. La exposición continua de los cultivos a 32°C puede causar la muerte de las moscas. En su hábitat natural la duración del ciclo es más variable como resultado de los cambios climáticos y la adversidad del ambiente.

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CAPÍTULO I: GENERALIDADES 5

Fig. 2. Ciclo de vida de Drosophila melanogaster que muestra el desarrollo de las estructuras de los órganos del adulto.

6 MANUAL DE LABORATORIO DE GENÉTICA

Huevo

La penetración del espermatozoide tiene lugar a través de una abertura llamada micropilo que se encuentra en el extremo anterior del óvulo. Los espermatozoides quedan almacenados en la hembra después de la cópula; luego de la fecundación los huevecillos quedan en el útero durante los estadios más tempranos del desarrollo embrionario y posteriormente se depositan en el medio de cultivo. El huevo es de color blanco lechoso, tiene una longitud promedio de 420 mieras (1μ = 10 -3^ mm), la superficie dorsal es aplanada y la ventral algo convexa, tiene un par de filamentos delicados que son extensiones del corion situados en la región anterodorsal, los cuales impiden que se hunda el huevo en la superficie blanda del medio de cultivo (Fig. 2). El huevo maduro está revestido por dos membranas, la interna es transparente y corresponde a la membrana vitelina la cual rodea el contenido protoplasmático, mientras que la externa o corion es firme, opaca y está ornamentada con figuras hexagonales o pentagonales producidas por las impresio- nes de las células foliculares ováricas.

Larva

Después de un día de desarrollo embrionario, eclosiona del huevo una pequeña larva; el color del cuerpo es blanco y está formado por doce segmentos no aparentes: 1 segmento de la cabeza, 3 torácicos y 8 abdominales (Fig. 2). La pared del cuerpo de la larva está formada por una cutícula externa y una epidermis celular interna. La cutícula está formada por la capa externa o exocutícula y la interna o endocutícula. En cada segmento del cuerpo la cutícula lleva en el borde anterior un anillo con pequeños ganchos quitinosos que se originan a partir de la exocutícula. Una característica principal del segmento de la cabeza es la presencia de ganchos bucales de color oscuro, los que son reemplazados en cada muda. Las estructuras internas de la larva son fácilmente distinguibles cuando se observan a través de la luz, ya que su cuerpo es translúcido. En la figura 3 se muestran las diferentes estructuras internas de la larva. La larva presenta dos linajes celulares diferentes; las células larvarias y las imagales. Las células larvarias forman el cuerpo de la larva, se caracterizan porque han perdido la capacidad de división y sólo aumentan su volumen; en algunas se presentan cromosomas politénicos, son poliploides y están determinadas y diferenciadas genéticamente. Las segundas no están involucradas en la formación del cuerpo de la larva y son distinguibles de las primeras porque las células imagales tienen tamaño pequeño, constitución cromosómica diploide, retienen la capacidad de división celular, están deter- minadas genéticamente pero se diferencian hasta que la larva entra a la metamorfosis; estas células se localizan en estructuras características denominadas discos imagales, los cuales son primordios celulares que incrementan su tamaño al multiplicarse el número de células mediante divisiones mitóticas que ocurren en momentos particulares durante el desarrollo larvario. En la figura 4a, se muestra cada uno de los discos imagales. La actividad larvaria es evidente a través de los surcos y canales que forman las larvas ya que éstas son muy voraces; las huellas son indicadoras de que la siguiente generación se desarrolla con éxito. Finalmente, las larvas se retiran del medio y migran a sitios menos húmedos de los frascos de cultivo en donde pupan.

8 MANUAL DE LABORATORIO DE GENÉTICA

CAPITULO I: GENERALIDADES 9

Pupa

En la última muda larvaria, que es delgada y blanquecina al principio y se endurece y torna oscura

posteriormente, se forma el pupario (Fig. 2). Durante la metamorfosis, la hormona ecdisona desen-

cadena una serie de cambios en el organismo, los cuales involucran la destrucción de ciertos tejidos

y órganos larvarios (histólisis) y la organización de las estructuras del adulto a partir de un complejo

de células primitivas, los llamados discos imagales. Los órganos que son completamente histolizados

durante la metamorfosis son las glándulas salivales, el intestino, los cuerpos grasos y los músculos.

La mayor parte de los órganos del adulto se forman a partir de los discos imagales ya presentes en la

larva o por células larvarias que se diferencian al ocurrir la reorganización del estado pupal; los tubos

de Malpighi se alteran poco durante la metamorfosis aunque sí sufren algunos cambios en su com-

posición estructural. El tórax se forma por la combinación de varios discos imagales. Las extremi-

dades locomotoras, los ojos, las antenas, las alas y el aparato genital se diferencian a partir de su

disco imagal respectivo, que sufre una histogénesis durante el desarrollo pupal dando origen a las

distintas partes del cuerpo del adulto (Fig. 4b). El estado pupal toma de 3 a 5 días y termina cuando

emerge el imago o adulto.

Adulto

El imago rompe el extremo anterior del pupario, por donde sale. Al principio el cuerpo de la mosca

es alargado, sin el pigmento característico y tiene las alas totalmente plegadas; durante una hora

aproximadamente la mosca inyecta linfa a las alas (que son una especie de sacos que se extienden en

forma gradual hasta quedar turgentes), el contacto con el aire seca las alas que posteriormente son

vaciadas al excretar la mosca el exceso de linfa. A medida que pasan las horas el adulto adquiere su

color característico. Ésta es la etapa reproductiva del ciclo de vida de este organismo; el imago alcanza

la madurez sexual a las 8 o 9 horas de edad (Fig. 2).

MORFOLOGÍA EXTERNA DEL ADULTO

En la gran mayoría de los trabajos con Drosophila melanogaster, se utilizan sus características mor-

fológicas como el tipo, la forma y/o disposición de sus estructuras. En particular, en los estudios ge-

néticos resulta indispensable conocer de una manera general la morfología externa del adulto, para

poder distinguir las características que presentan las moscas de tipo silvestre de aquellas que pueden

estar modificadas por mutaciones (Fig. 5).

Cabeza

En la estructura general de los insectos la cabeza se forma por 6 segmentos: 1) labrum, 2) clipeus, 3)

antenal-ocular, 4) mandibular, 5) maxilar y 6) labial (Fig. 6a y b).

En la cabeza se encuentran sobre todo los órganos de los sentidos. La parte frontal está comple-

tamente formada por el tercer segmento antenal-ocular. Los ojos compuestos son relativamente

Fig. 6. Estructura general de la cabeza de Drosophila; a) aspecto cefálico, b) aspecto lateral, c) aspecto de las omatidias y las setas de los ojos compuestos, d) segmentación de la antena, é) base de la arista. (Modificado de Demerec, M. Ed., 1965, Biology of Drosophila.)

CAPITULO I: GENERALIDADES 11

1 2 MANUAL DE LABORATORIO DE GENÉTICA

grandes, están separados con amplitud y son del mismo tamaño y forma en los dos sexos, presentan setas pequeñas y rígidas que surgen de cada ángulo de unión de las aproximadamente 800 omatidias que los conforman (Fig. 6c). Los tres ocelos se encuentran juntos en un arreglo triangular en la parte superior de la cabeza. Entre los ojos están las antenas, que se encuentran muy cercanas entre sí, y están formadas por 6 segmentos: los tres primeros son muy pequeños y presentan pequeñas espinas; en el segundo aparecen numerosas cerdas alargadas de varios tamaños; el tercer segmento consti- tuye una estructura bulbosa; los segmentos 4 y 5 unen esta estructura con el último segmento que forma una porción racimosa llamada arista (Fig. 6d y e). Por debajo de los ojos se encuentra una cresta conocida comúnmente como carina, que muestra una hilera de setas denominada vibrisa (Fig. 6a y b). En la región ventral de la cabeza se encuentran las partes bucales: el labrum y el clipeus, que están altamente modificadas con respecto al plan general de los insectos ya que forman un aparato chupador o proboscis. Toda la estructura de la proboscis involucra el clipeus, el labrum, la maxila muy reducida y el labium muy alargado. No se presentan mandíbulas (Fig. 6a y b). La proboscis puede dividirse en tres regiones: la basiproboscis, incluye clipeus, palpos maxilares, lóbulos maxilares y labrum; la proboscis media, en la que se articulan los palpos labiales, y la disti- proboscis o región apical de la proboscis, en la que se forman dos grandes lóbulos membranosos conocidos como labelo y que representan palpos labiales. En la cabeza se presentan también numerosas cerdas, algunas muy grandes, designadas por términos derivados de sus posiciones: ocelares, orbitales, frontales y verticales, entre otras.

Tórax

El concepto convencional del tórax de los insectos asume que las paredes de cada segmento invo- lucran transversalmente una placa dorsal o terguito, una placa lateral o pleurito en cada lado entre las alas y la base de las patas, y una placa ventral o esternito entre las bases de las patas. El tórax se forma de tres segmentos: el protórax o segmento anterior, el mesotórax o segmento medio y el metatórax o segmento posterior. Todos los segmentos del tórax de Drosophila se encuentran fu- sionados formando una caja casi sólida. El protórax por sí mismo es muy reducido y sólo sirve de soporte para el primer par de patas. La porción dorsal o notum es exclusivamente un collar estrecho que se extiende a través del tórax, está fusionado posteriormente con el mesonotum (porción dorsal del mesotórax) y lateralmente con los elementos pleurales de su propio segmento, separados por un pliegue (Fig. 5a y b). Los esternitos son dos pequeñas placas ventrales que separan las coxas de las patas. Posteriormente, justo entre las bases de las alas, el escutum se separa por una línea de depresión del pequeño escutelo en forma de placa. Los grandes pelos del tórax ocupan una posición casi definitiva y fija, están formados por dos tipos de células, tricogénicas y termogénicas con funciones nutricional y sensorial respectiva- mente. Las setas dorsocentrales, los postalares y los escutelares son importantes fenotípicamente (Fig. 5a y b). Los dos segmentos en los que aparecen las alas están estrechamente unidos y son nombrados en forma colectiva como "pterotórax". Se presenta un marcado alargamiento del mesotórax y una reducción del metatórax, por lo que las alas mesotorácicas tienen la función total del vuelo, mientras