GUIA PARA PRÁCTICAS DE LABORATORIO,
TALLER O CAMPO
Código de documento:
DCVI-GUI-V1-2020-010
Código de documento: DCVA-GUI-V1-2022-007
Código de proceso: FRM 6.3 Rev. UPDI: 2022-may-16
DEPARTAMENTO:
CIENCIAS DE LA VIDA Y DE LA
AGRICULTURA
CARRERA:
☐ Ing. Agropecuaria ☒ Ing. Biotecnología
ASIGNATURA:
Biología Molecular Aplicada
NIVEL:
5to
PERÍODO LECTIVO:
SI 202550
DOCENTE:
Marcelo Grijalva
NRC:
23369-23375
PRÁCTICA N°:
6
LABORATORIO DONDE SE DESARROLLARÁ LA PRÁCTICA:
Laboratorios Multidisciplinarios
TEMA DE LA
PRÁCTICA:
Parte 1: amplificación mediante PCR end-point del gen 16S rRNA a partir de DNA de aislados clínicos de S.
aureus
INTRODUCCIÓN:
El diagnóstico molecular ha tomado relevancia desde la invención de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) por el
bioquímico Kary Mullis, por el que acuñó un premio Nobel en 1993. Esta técnica ha permitido hallar segmentos cortos de ADN o ARN
en medio de extensas cadenas de ácidos nucleicos, a través de la amplificación del número de copias de dichos segmentos con
ayuda de una enzima llamada ADN polimerasa [1]. Este proceso que genera millones de copias del fragmento deseado, a fin de que
este pueda ser detectado, permitió la culminación efectiva del Proyecto Genoma Humano [2].
La PCR es actualmente la técnica molecular más ampliamente desarrollada por ser un método rápido y de alta sensibilidad de
detección. El uso de la PCR se ha expandido a aplicaciones clínicas, como la detección y monitoreo de patógenos, evaluación de
infecciones emergentes, detección temprana de agentes biológicos nocivos, y perfiles de resistencia antimicrobiana (RAM). Puede
incluso ser utilizada para la detección de factores de virulencia y en organismos de lento crecimiento o no cultivables como la mayoría
[3].
La PCR es el estándar de oro en el diagnóstico molecular, debido a que permite la ejecución de la reacción en un instrumento
automatizado que reemplaza las operaciones manuales y el uso reactivos que aumentan la especificidad de la PCR, eliminando la
contaminación cruzada y la inhibición, reduciendo el tiempo de reacción y aumentando la capacidad de multiplexación. A pesar de
ello, existen varios desafíos y limitaciones que afrontar, como son la calidad de las muestras de ácidos nucleicos, la presencia de
inhibidores de PCR que aumentar el riesgo de obtener resultados falsos negativos o límites de detección más altos y complicaciones
de la amplificación de secuencias ricas en GC por la generación de estructuras secundarias que dificultan la desnaturalización [4].
A nivel de diagnóstico, la resistencia antimicrobiana ha generado particular atención al estimarse que en 2050 las muertes provocadas
por RAM podrían llegar a 10 millones de personas por año, siendo la causa principal el mal uso y abuso de antimicrobianos ante
infecciones que pueden o no ser bacterianas [5]. Staphylococcus aureus es uno de los patógenos oportunistas de mayor
preocupación a nivel mundial, debido a sus factores de virulencia, elementos móviles de transmisión de genes de resistencia
antimicrobiana, y capacidad de adaptarse y crecer bajo diferentes condiciones ambientales y sobrevivir sobre objetos inanimados.
S. aureus resistente a meticilina se ha diseminado a nivel mundial como una es una de las causas más frecuentes de infecciones a
nivel hospitalario, pudiendo llegar a desarrollar resistencias a múltiples antibióticos de no ser correctamente tratada [6].
El gen 16s rRNA (ARN ribosomal bacteriano) permite la identificación molecular de S. aureus mediante PCR y también se utiliza
como gen de referencia, ya que, su expresión se mantiene constante en experimentos de expresión génica [7]. A pesar de ello, 16S
tiene un papel en el diagnóstico, usualmente asociado a otras técnicas analíticas como espectrometría de masas [8]. El gen de la
nucleasa termoestable, nuc, se utiliza como marcador para la identificación especifica de S. aureus mediante PCR, técnica que
permite el diagnóstico rápido de infecciones por S. aureus mediante pruebas directas en muestras clínicas [9].
Así también, se ha utilizado PCR para la identificación rápida de cepas resistentes, lo que es crucial para el tratamiento con
antibióticos efectivos reduciendo la tasa de mortalidad. Las cepas de S. aureus se vuelven resistentes a meticilina por la adquisición
del gen mecA que codifica PBP2a, enzima que reduce la afinidad de unión a los antibióticos betalactámicos, lo que compromete su
acción inhibidora sobre el ensamblaje de la pared celular [10]. Este gen es parte del cassette estafilocócico cromosómico (SCCmec),
que es un elemento genético móvil que se incorpora al genoma de S. aureus y, por lo tanto, es identificable usando primers
específicos del gen [11].
