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Laboratorio
Informe laboratorio: siembra en medios de cultivo
Estudiantes:
Valentina Gutiérrez Jiménez y Britny Alexandra Cardona Mancera
Introducción
Como ya sabemos, la microbiología es la ciencia que estudia a los microorganismos, y para poder estudiarlos de manera adecuada y eficiente, lo mejor que podemos hacer es aislarlos, esto para ver cómo se comporta una o más colonias sin otros factores presentes. Todo esto se consigue mediante distintas técnicas de desinfección y esterilización para dejar el medio sin otro microorganismo presente, además de técnicas de cultivo para sembrar la colonia en el medio. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo son: Agar: se utiliza como agente solidificante. Es un polisacárido que se obtiene de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo Azucares : son una fuente de carbono para los microorganismos. Los más empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa Extractos: son preparados de ciertos órganos o tejidos animales o vegetales, obtenidos con agua y calor Peptonas: son proteínas hidrolizadas, se obtienen por digestión química o enzimática de proteínas animales o vegetales Fluidos corporales: sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero sanguíneo son añadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos microorganismos patógenos Sistemas amortiguadores: son sales que se añaden al medio para mantener el pH dentro del rango óptimo del crecimiento bacteriano. El fosfato bisodico o bipotasico Indicadores de pH: son indicadores acido-base que se añaden para detectar cambios de pH en el medio. Algunos tipos de medios de cultivo son: por consistencia: Liquido: se denominan caldos y se preparan en tubos o Erlenmeyer Solido: son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus componentes, se preparan en placas de Petri Por su composición: Medios generales: permite el desarrollo de una gran variedad de microorganismos Medios de enriquecimiento : favorecen el crecimiento de un determinado grupo de microorganismos sin inhibir totalmente el crecimiento del resto Medios selectivos: permite el crecimiento de un tipo de microorganismo determinado inhibiendo el desarrollo de los demás
Objetivos
Conocer las distintas técnicas de aislamiento de medios de cultivos sólidos para la obtención de colonias aisladas. Conocer y aprender a desarrollar la preparación de los diferentes medios de cultivo Obtener un cultivo aislado a partir de una muestra de microbios preexistente Aprender sobre los distintos medios de cultivo existentes
Materiales y reactivos
Agar Sangre Agar Chocolate Agar Mueller- Hinton Sensidiscos Hisopo Baja lenguas Lamina portaobjetos Asa redonda Pinzas Mechero Incubadora
Consulta previa:
1) ¿Qué medios de cultivo se usan con frecuencia para aislar bacterias Gram
negativas?
Los medios de cultivo presentan características de aislamiento selectivo y diferencial, el agar MacConkey se utiliza para el aislamiento selectivo y la identificación de las bacterias Gram negativas y estéricas. El agar MacConkey tiene cristal violeta y sales biliares las cuales gracias a la acción de ácidos puede aislar a aquellos organismos que poseen la capacidad de fermentan la lactosa (estéricos) he impiden el crecimiento de bacterias Gram positivas
de soluto y solvente luego se calienta en fuego moderado y se revuelve hasta disolver todo el polvo en la mezcla Segundo paso: esterilizar Una vez disuelto la mezcla se debe esterilizar a una temperatura de 121°C por 20 minutos. Tercer paso: agregar sangre Posteriormente se deja enfriar hasta que la temperatura oscile entre 40 a 50 °C la sangre se debe agregar desfibrilada (remoción del factor de coagulación sanguínea) 50 ml por cada litro de agar, se debe mezclar suavemente para homogenizar Este paso es crucial pues si la sangre se agrega cuando el medio esta muy caliente los glóbulos rojos se romperán y el medio no servirá para observar la hemolisis (proceso que se explico anteriormente) y si se agrega cuando está demasiado frio se formaran grumos y la superficie del agar no quedara lisa para poder realizar el estriado adecuadamente Cuarto paso: verter en la capa de Petri La mezcla se debe servir en placas de Petri estériles justo después de la homogenización de la sangre, en cada placa se vierte aprox 20ml es importante realizar este paso cerca de un mechero para que la muestra no se contamine, al momento de servir no deben quedar burbujas en la superficie de la placa si esto sucede se pasa fuego sobre el agar rápidamente para eliminarlas Las placas se deben solidificar y finalmente guardar en nevera (2-8°C) de forma invertida hasta su uso.
Usos del agar sangre:
El medio de cultivo agar sangre es uno de los mas comunes del laboratorio principalmente crecen en el bacterias anaerobias, aerobias, facultativas, Gram positivas o Gram negativas también crecen bacterias exigentes desde el punto de vista nutricional, hongos y levaduras Este medio de cultivo se utiliza también para reactivar (subcultivar) cepas que metabólicamente se encuentren muy débiles
3) ¿Cómo se prepara el agar chocolate? ¿Cuáles son sus usos?
Este medio esta hecho de una base rica en nutrientes y sangre calentada, este medio posee los factores X (hemina) y V (NAD) indispensables para el crecimiento de algunos microorganismos de género Haemophilus. También se utiliza para el aislamiento de Neisserias sp. El agar chocolate posee suplementos enrriquecidos que contienen vitamina B12 L- glutamina, ,clorhidrato de guanina, adenina , pirofosfato de tiamina, nitrato férrico, clorhidrato de tiamina, hidrocloruro de cisteína, L-cistina , glucosa y ácido p-aminobenzoico, nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) Algo importante del agar chocolate es que es mas rico en nutrientes que el agar sangre pero no tiene la capacidad de la observación de patrones de hemolisis
¿Qué son los factores v y x?
El factor v es trastorno hemorrágico que afecta la capacidad de la sangre de coagularse El factor x es una proteína con propiedades enzimáticas que participan en la coagulación sanguínea
Preparación:
Primer paso: se deben observar la tabla de contenidos y calcular
aminoácidos y minerales; si adicionalmente se le agrega al medio suplemento para brucella se puede aislar al mencionado microorganismo es mas eficaz si se usa sangre de caballo Agar chocolate preparado con base GC (para gonococos) este medio contiene peptonas, almidón de maíz, buffers, cloruro de sodio, mezcla sintética de hemina, vitaminas, minerales, aminoácidos, suplemento quimico de factor de crecimiento y factor V Agar chocolate preparado con agar Müeller Hinton Su principal función es realizar la prueba susceptibilidad de microorganismos exigentes, como Streptococcus pneumoniae y para el de aislamiento de Haemophilus
Procedimiento experimental:
PARA UNA CORRECTA REALIZACIÓN DE LA SIEMBRA SON NECESARIAS CIERTAS
CONDICIONES :
Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la ESTERILIZACION, proceso que consiste en conseguir que todos los microorganismos presentes mueran desde el punto de vista microbiológico. 1) Se procedió a encender el mechero, y se dispusieron todos los demás materiales a utilizar cerca de él, ya que este previene la contaminación de las muestras con microorganismos provenientes del aire 2) Realice un frotis de garganta 3) Con el Hisopo realice un extendido sobre la lámina portaobjetos 4) Descarte el hisopo 5) Con un nuevo Hisopo tome parte de la muestra de garganta siguiendo indicaciones del docente 6) siembre por agotamiento (esparce el hisopo) en alguna parte de los agares sangre y chocolate 6) Luego, cuidando de mantener siempre todos los materiales cerca del mechero, se procedió a colocar el asa sobre el fuego del mechero hasta que esté al rojo vivo, de modo tal de quedar esterilizada. 7) Se enfrió el asa 8) Se untó la punta del asa a la muestra que se unto en la placa de Petri
9) Se esparció el asa por el agar del medio escogido, en forma de zig-zag o S, cubriendo la mitad del área de la placa de Petri, con cuidado de no aplicar demasiada presión, para evitar romper el agar. Como muestra la imagen. 10) La muestra antes esparcida, se volvió a esparcir, cubriendo ahora la mitad del área que se había cubierto. 12) Por última vez, se volvió a esparcir la muestra antes esparcida, cubriendo el área restante de la placa de Petri. 13) Finalmente, se selló la placa de Petri.
14) por último , Lleve a incubar a 37oC por 24 horas ( todo esto se realizó en los dos agares,
el de chocolate y el de sangre) ANTIDIOGRAMA Materiales: Bacteria identificada Antibiótico (sencidisco) Pinzas Medio de cultivo mueller-hinton
Procedimiento experimental:
- Después de tener el tubo de la bacteria, meter el hisopó y empaparlo
- Destapar la caja de Petri y esparcir con el hisopo varias veces uniformemente (orillas también)
- Seleccionar cuidadosamente los 4 discos con las pinzas y ponerlas en cruz
Resultados
En el Agar chocolate y sangre se observó que claramente hubo crecimiento de microorganismos, y que se lograron aislar varias colonias, que se identifican como pequeñas manchas en la placa de Petri
2. ¿ cómo se identifica una bacteria? La identificación bacteriana se realiza por medio de esquemas basados en características fenotípicas, el método tradicional de identificación fenotípica se basa en: Observación: se observa su morfología, desarrollo, propiedades químicas y metabólicas Características microscópicas: medios de cultivo en el que se encuentran, requisitos de crecimiento en relación con la atmosfera, temperatura y nutrición Pruebas bioquímicas diferenciadoras: a las bacterias se les realizan pruebas para identificarlas con lecturas inmediatas como la catalasa y oxidasa también hay pruebas menos inmediatas como la hidrolisis hipurato, la β-galactosidasa (ONPG) y las aminopeptidasas y otras aun mas lentas las cuales son hidrólisis de la esculina, coagulasa, fenilalanina- desaminasa, DNasa, hidrólisis de la gelatina, decarboxilasas, lipasa, lecitinasa, utilización de citratos, utilización de malonato, y prueba de CAMP entre otras mas. Como se puede evidenciar en el mercado existen muchas pruebas para la diferenciación de estos microorganismos algunos mas rápidos que otros, el tiempo del resultado de la prueba Circular^ Rizoide Filamentosa Fusiforme Redondeado Espiculado Morfologías bordes Ondulado (^) Filamentoso Lobulado Rizoide
depende de múltiples factores, la complejidad del microorganismo y el poder tener a la mano los reactivos y equipos para realizarlas. Métodos moleculares: Cuando el método fenotípico realiza la la identificación mas probable y no la definitiva se opta por realizar este tipo de método, no todas las cepas de una misma especie muestran las mismas características especificas una misma cepa podría mostrar resultados distintos en el mismo ensayo por esto se han implementado los métodos genotípicos de identificación bacteriana como un procedimiento alternativo o complementario. En este método se utilizan una amplia variedad de genes de distintas especies bacterianas constituyendo un análisis del ARNr 16S el marcador inicial para determinar numerosas frecuencias con utilidad taxonómica bacteriana.
3. ¿Qué es la prueba de la catalasa y cual es su principio? La prueba catalasa pretende manifestar la presencia de la enzima catalasa en un medio de cultivo donde haya bacterias, esta enzima posee la capacidad de descomponer el peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno, con la consiguiente aparición de burbujas. Básicamente el objetivo de esta prueba es la diferenciación de Streptococcus y Staphylococcus. Todas las especies de Streptococcus son catalasa negativa y Staphylococcus son catalasa positiva. Esta prueba se hace de una forma fácil y rápida esto la hace muy útil en el laboratorio de microbiología
Procedimiento:
Coloque una gota de peróxido de hidrógeno al 3% en un portaobjetos de microscopio Hacerse con una colonia de bacterias a prueba de la placa de agar utilizando un bucle bacteriana o punta de pipeta Agitar la colonia bacteriana en el peróxido de hidrógeno y el reloj para que se formen burbujas
Resultado:
Si la colonia bacteriana es Staphylococcus, abundantes burbujas se verán de forma inmediata Si no aparecen burbujas, la colonia es una especie Streptococcus
el patron 0,5 de Mc Farland corresponde a aprox una suspensión homogénea de Echerichia coli de 1,5 x 10^8 celulas por ml
Conclusiones:
Los medios de cultivo son indispensables para poder estudiar, separar y sembrar diferentes tipos de bacterias además de esto es importante conocerlos ya no todos son óptimos para la conservación y reproducción de las mismas clases bacterianas ya que de esto depende el ambiente nutricional que ellos proporcionen, las bacterias son estrictas con su metabolismo por eso en donde crece una que descomponga lactosa no crecerá aquella que no tenga la capacidad de hacerlo con esto confirmamos que al utilizar un método de siembra se debe tener en cuenta la técnica debido a que esta varia con respecto a las características del microorganismo tratado, los métodos de cultivo tienen varios fines entre ellos están la multiplicación, identificación, antibiogramas y gracias a ellos podemos obtener información valiosa de los mismos trabajando de una forma higiénica evitando la contaminación del medio y la alteración de los resultados En cuanto al antibiograma realizado pudimos observar según los resultados que nuestras bacterias no se esparcieron por agar indicándonos que los antibióticos utilizados son aptos para combatirás y pudimos aprender que cuando la siembra proviene de un área no estéril se recomienda adicionar estos antibióticos par inhibir la flora normal del área haciendo que el resultado no se afecte con la aparición de estos microorganismos normales que se encuentran en zonas especificas del cuerpo y que a concentraciones moderadas no le hacen daño al huésped Por Ejemplo: para muestras respiratorias donde se sospeche la presencia de bacterias del género Haemophilus se usa bacitracina para inhibir el crecimiento de Staphylococcus, Micrococcus, Streptococcus y Neisserias saprófitas.
