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OBJETIVOS DE APRENDIZAJE:
- Reconocer y diferenciar los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
- Ilustrar el mecanismo por el cual ciertos factores afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas.
- Utilizar aquellos factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas para comprender cómo se regula el trabajo de las enzimas en los organismos biológicos.
- Discutir los efectos de las variaciones bruscas de factores como temperatura y pH en el funcionamiento adecuado de los organismos.
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
LABORATORIO BIOQUÍMICA
Alumno: Código: Alumno: Código: Práctica 5 : ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA – AMILASA: EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN, EL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA.
1. FUNDAMENTO TEÓRICO Estudio cinético del enzima α-amilasa: Introducción a la enzimología La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren las reacciones enzimáticas. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir: 1. Por la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo. 2. Por la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo.
2.1 Normas de seguridad El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad. 2.2 Equipos de protección personal Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad:
- Bata de laboratorio
- Guantes de nitrilo
- Gafas de seguridad Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su intercambio con los demás compañeros de laboratorio. 2.3 Manejo de Residuos químicos Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el estudiante debe: Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no controladas y potencialmente peligrosas. No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le indicará la forma correcta de hacerlo. En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato [S], del enzima [E], el pH y la temperatura (T °C) sobre la velocidad de la reacción catalizada por el enzima α-amilasa salival, al hidrolizar los enlaces α-1, del almidón. Para ello nos basaremos en la hidrólisis del almidón por unidad de tiempo, mediante la prueba de yodo. La prueba de yodo se basa en la coloración oscura que produce la interacción del almidón con el ión yoduro presente en el reactivo de Lugol. Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen, así como sus respectivos productos de hidrólisis, con el reactivo de Lugol. Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: [S], [E], pH y T °C, fundamentalmente. 2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA
4.2 Reactivos Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja. Reactivos Cantidad Lugol (en frasco ámbar con tapa gotero) 25mL Almidón al 0,5% 30mL Soluciones tampón de pH 4 2 mL Soluciones tampón de pH 7 2 mL Agua destilada 50mL Hielo
5. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Preparación de muestra de amilasa:
- Obtenga aproximadamente 1 mL de amilasa salival de su boca en una probeta y complete hasta 20 mL con agua destilada.
- Esta solución es el EXTRACTO ENZIMÁTICO. I. Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática.
- Rotule 4 tubos de ensayo y agregue 2 mL de almidón al 0,5%
- Encuentre la cantidad de lugol necesaria para detectar la solución de almidón proveída en esta práctica. Para ello tome 3 gotas de uno de los tubos preparados en el punto 1 y adicione 1 gota de lugol. Repita el procedimiento aumentando a 2 y 3 gotas de lugol. Escoja la menor cantidad que de una coloración fuerte.
- Llévelos tubos preparados en el paso 1 a 37 °C en baño maría y mantenga la temperatura constante.
- Agregue en el siguiente orden 2.9 mL, 2.8 mL, 2.7 mL y 2.6 mL de agua destilada a los tubos de ensayo.
- Luego en el mismo orden, adicione: 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL y 0.4 mL del extracto enzimático. En este momento empieza la reacción (t 0 )
- En placas para ELISA, tome 3 gotas de cada reacción y agrégueles 1 gota de lugol (o la cantidad que usted determinó apropiada). Repita este procedimiento cada 2 minutos durante los primeros 20 minutos de reacción. Para los 40 minutos restantes tome muestras cada 10 minutos.
- Tiendo en cuenta la escala presentada en la Figura 1 asígnele un valor a cada muestra según la coloración que observa y consigue sus resultados en la bitácora en una tabla como la que se muestra en la Tabla 3. Figura 1. Escala de colores obtenidos por la interacción entre el lugol y el almidón hidrolizado y sin hidrolizar Consulte con su instructor sus resultado para ajustar los tiempos y volúmenes de los siguientes experimentos de acuerdo con la velocidad de su amilasa salival (resultados varían según grupo). II: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática.
- En dos tubos de ensayo agregue 2 mL de almidón al 0.5 %, rotúlelos y agregue 2.8 mL de buffer pH 7.0 a uno y 2.8 mL de buffer pH 4.0 al otro, o según lo indique su instructor (Si los volúmenes que empleó no son los acá indicados escríbalo en la bitácora y tenga en cuenta eso a la hora de escribir su informe).
- Incúbelos a 37 °C en baño maría y mantenga la temperatura constante.
- Agregue 0.2 mL del extracto enzimático a cada Erlenmeyer o según lo indique su instructor (Si los volúmenes que empleó no son los acá indicados escríbalo en la bitácora y tenga en cuenta eso a la hora de escribir su informe). Aquí comienza la reacción (t 0 ).
- En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de lugol (o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reacción. Repita este procedimiento en intervalos de 3 minutos durante 30 minutos o según lo indique su instructor.
- Tiendo en cuenta la escala presentada en la Figura 1 asígnele un valor a cada muestra según la coloración que observa y consigue sus resultados en la bitácora en una tabla como la que se muestra en la Tabla 4.
cada muestra según la coloración que observa y consigue sus resultados en la bitácora en una tabla como la que se muestra en la Tabla 6.
6. RESULTADOS I. Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática. Tabla 3 Datos crudos del estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática Tiempo de reacción (Min) Observación Tubo 1 (0.1 mL Enz) Tubo 2 (0.2 mL Enz) Tubo 3 (0.3 mL Enz) Tubo 4 (0.4 mL Enz) 0 10 20 30 40 50 60
- Copie la Tabla 3 en su bitácora y durante el experimento vaya ingresando los valores correspondientes a sus observaciones.
- Con los datos obtenidos construya un gráfico de concentración de sustrato (corresponde al valor asignado a la coloración observada) en el eje ordenado contra tiempo en el eje abscisas e incluya la leyenda del gráfico indicando en volumen de enzima agregada para cada tubo. Incluya las cuatro curvas en el mismo gráfico para facilitar su comparación
- Calcule la velocidad de la reacción para cada concentración enzimática teniendo en cuenta la clase de teoría y las consultas previas de la práctica
- Describa lo que observa en la gráfica y los valores de las velocidades calculadas para cada volumen enzimático.
II: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática Tabla 4 Resultados del pH sobre la actividad enzimática
- Copie la Tabla 4 en su bitácora y durante el experimento vaya ingresando los valores correspondientes a sus observaciones.
- Con los datos obtenidos construya un gráfico de concentración de sustrato (corresponde al valor asignado a la coloración observada) en el eje ordenado contra tiempo en el eje abscisas e incluya la leyenda del gráfico indicando el pH en cada tubo. Incluya las dos curvas en el mismo gráfico para facilitar su comparación
- Calcule la velocidad de la reacción para cada pH teniendo en cuenta la clase de teoría y las consultas previas de la práctica
- Describa lo que observa en la gráfica y los valores de las velocidades calculadas para cada pH. Tiempo de reacción (Minutos) Observación pH 7.0 pH 4. 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
IV: Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática Tabla 6. Efecto de la concentración de sustrato sobe la actividad enzimática
- Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentración de sustrato creciente en nuestro experimento). Recuerde incluir la leyenda del gráfico. OJO! NO ES IGUAL A LOS GRÁFICOS ANTERIORES
- A partir del gráfico anterior realice el doble recíproco (1/ velocidad vs 1/[S]) e incluya la leyenda de la gráfica
- Calcule la constante de Michaelis-Menten, la constante catalítica y la eficiencia (usando el volumen de enzima como concentración) a partir de las gráficas anteriores, teniendo en cuenta lo visto en clase.
- Realice una tabla con los valores de las constantes de su enzima y las de sus compañeros e incluya la leyenda correspondiente.
- Describa los resultados de las gráficas haciendo referencia a las mismas y compare los valores de las constantes calculadas para cada grupo resaltando la de mayor afinidad al sustrato, la de mayor velocidad y la mas eficiente haciendo referencia a la tabla Tiempo de reacción (Minutos) Observación Tubo 1 (vol sustrato) Tubo 2 (vol sustrato) Tubo 3 (vol sustrato) Tubo 4 (vol sustrato) 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
7. ANÁLISIS DE RESULTADOS
I. Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática.
- Describa qué características estructurales del almidón permiten su identificación mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidón.
- Explique los resultados obtenidos teniendo en cuenta el modelo de la cinética enzimática descrito por Michaelis-Menten. ¿Se ajustan a lo esperado? Por qué?
- Consulte con los demás grupos de trabajo las velocidades de reacción obtenidas para un volumen de 0.2 mL de extracto enzimático y regístrelos en una Tabla (incluya la leyenda correspondiente). Compare la suya con la de ellos, identificando la amilasa aparentemente más rápida y la más lenta, y dando una posible explicación para la variabilidad (si la hay). II: Efecto del pH sobre la velocidad de una reacción enzimática
- Describa las características generales de la alfa-amilasa tiendo en cuenta: estructura primaria y tridimensional de la enzima, especificidad de sustrato, pH óptimo, temperatura óptima y parámetros cinéticos (KM, kcat, Eficiencia). Si va a incluir imágenes no se le olvide la leyenda correspondiente y referenciarla en el texto.
- Teniendo en cuenta la información anterior, sus resultados corresponden a lo reportado para la enzima?
- Teniendo en cuenta las características estructurales de la enzima y la variación de pH en cada tubo, discuta a que se debe la diferencia en la velocidad de reacción registrada. III. Estudio del efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción enzimática
- Teniendo en cuenta la información anterior, sus resultados corresponden a lo reportado para la enzima?
- Teniendo en cuenta las características estructurales de la enzima y la variación de temperatura en cada tubo, discuta a que se debe la diferencia en la velocidad de reacción registrada.
