UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE ZACATECAS
UNIDAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LABORATORIO DE BIOPROCESOS
INGENIERÍA BIOQUÍMICA
LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGÍA
OBJETIVO
Conocer el uso y manejo de un espectrofotómetro UV-vis en el laboratorio y obtener el
espectro de absorción del p-nitrofenol y determinar, a partir del espectro, a) longitud de
onda donde más absorbe y b) realizar ua curva de calibración y c) calcular la
concentración de una muestra problema.
INTRODUCCIN
El fundamento de esta determinacin se basa en la capacidad de
reconocimiento de la enzima -glucosidasa por el sustrato sinttico
pNPG. La -glucosidasa hidroliza al pNPG, liberando glucosa y p-
nitrofenol. El p-nitrofenol es una sustancia de color amarillo que
puede determinarse espectrofotomtricamente a una longitud de
onda de 402 nm, en este caso el p-nitrofenol es un producto de una
reaccin enzimática.
La Espectrofotometría es una de las técnicas experimentales más utilizadas para la
detección específica de moléculas. Se caracteriza por su precisión, sensibilidad y su
aplicabilidad a moléculas de distinta naturaleza (contaminantes, biomoléculas, etc) y
estado de agregación (sólido, líquido, gas). Los fundamentos físico-químicos de la
espectrofotometría son relativamente sencillos.
Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía
interna. Esto permite que se inicien ciclos vitales de muchos organismos, entre ellos el
de la fotosíntesis en plantas y bacterias. La Mecánica Cuántica nos dice que la luz está
compuesta de fotones cada uno de los cuáles tiene una energía:
donde c es la velocidad de la luz, v es su frecuencia, λ su longitud de onda y
h= 6.6 10-34 J⋅s es la constante de Planck. Cuando decimos que una sustancia química
absorbe luz de longitud de onda λ, esto significa que las moléculas de esa sustancia
absorben fotones de esa longitud de onda.
En esta práctica estudiaremos la absorción de luz en el ultravioleta cercano (λ≈325-420
nm) y en el visible (λ ≈420-900 nm). Cuando una molécula absorbe un fotón en este
intervalo espectral, se excita pasando un electrón de un orbital del estado fundamental a
un orbital excitado de energía superior. De está manera la molécula almacena la energía
del fotón:
PRACTICA 3. ESPECTROFOTOMETRA
