¡Descarga Capítulo de Mckee Enzimas y más Guías, Proyectos, Investigaciones en PDF de Biología Molecular solo en Docsity!
C
A^
P
Í^
T^
U
L^
O
166
6 Enzimas
ESQUEMA
6.1 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS
6.2 CLASIFICACIÓN DE LAS ENZIMAS
6.3 CINÉTICA ENZIMÁTICA
Cinética de Michaelis-Menten Gráfi cas de Lineweaver-Burk Reacciones de sustratos múltiples Inhibición enzimática Cinética enzimática, metabolismo y hacinamiento macromolecular
6.4 CATÁLISIS Reacciones orgánicas y estado de transición Mecanismos catalíticos Función de los aminoácidos en la catálisis enzimática Funciones de los cofactores en la catálisis enzimática Efectos de la temperatura y del pH en reacciones catalizadas por enzimas Mecanismos detallados de la catálisis enzimática
6.5 REGULACIÓN ENZIMÁTICA Control genético Modificación covalente Regulación alostérica Compartimentación
Alcohol deshidrogenasa Las alcohol deshidrogenasas [ADH] son una clase de enzimas que protegen a los organismos de los efectos tóxicos de alcoholes endógenos y exógenos. Una gran proporción de las ADH requiere iones de cinc para propósitos catalíticos y estructurales.
6.1 Propiedades de las enzimas 167
Sinopsis
LOS BIOQUÍMICOS HAN INVESTIGADO LAS ENZIMAS [CATALIZADORES BIOLÓGICOS] POR MÁS DE 130 AÑOS. MUCHO ANTES DE QUE TUVIERAN UNA COMPRENSIÓN realista de las bases físicas del estado vivo, los bioquímicos apreciaron de manera instintiva la importancia de las enzimas. Con la aplicación de tecnologías concebidas por los bioquímicos, los biólogos fueron determinando gradualmente las propiedades de los sistemas biológicos. Este trabajo demostró finalmente que casi todo proceso en los seres vivos sucede a causa de reacciones catalizadas por enzimas. Hasta fechas recientes todas las enzimas conocidas eran proteínas, pero investigaciones innovado- ras revelaron que las moléculas de RNA también tienen propiedades catalíticas. Este capítulo trata sobre las proteínas catalíticas, mientras que las características de las moléculas catalíticas de RNA se describen en el capítulo 18.
S
in enzimas, la mayor parte de las miles de reacciones bioquímicas que sustentan los procesos vitales ocurrirían a velocidades imperceptibles. Determinaciones recientes de las velocidades de las reacciones no catalizadas (no mejoradas) en agua van desde 5 s para la hidratación del CO 2 hasta 1 100 millones de años para la descarboxilación de la glicina. En contraste, las reacciones catalizadas por enzimas suelen ocurrir en lapsos que van de los microsegundos a los milisegundos. De hecho, las enzimas son el medio por el cual los organismos canalizan el flujo de energía y materia. En la actualidad, como resultado de la acumulación de datos procedentes de la dinámica de proteínas (estudios de movimiento conformacional) y del análisis del hacinamiento macromolecular, la investigación de enzimas está experimentando cambios revolucionarios. Por ejemplo, según los puntos de vista tradicionales, el fun- cionamiento de las enzimas depende casi por completo de las formas complementarias y de las interacciones catalíticas entre las moléculas reactivas y sus sitios de unión más o menos flexibles. Sin embargo, en fechas recientes se demostró que la función catalítica de determinadas enzimas puede vincularse con movimientos internos que se extienden por toda la molécula de proteína. De modo similar, ahora se reconoce que las enzimas funcionan en condiciones muy distintas de aquellas en las que se han estu- diado (p. ej., moléculas purificadas en baja concentración). Por el contrario, el ambien- te in vivo de las enzimas es un medio hacinado parecido a un gel. Como resultado de investigaciones recientes, los modelos de la cinética enzimática están evolucionando y los métodos de experimentación, de colecta de datos y de simulación se hacen más sofisticados y más próximos a las condiciones reales in vivo. En el presente capítulo se revisan las propiedades estructurales y funcionales de las enzimas.
6.1 PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS
Las enzimas poseen varias propiedades notables (cuadro 6.1). En primer lugar, las ve- locidades de las reacciones catalizadas por enzimas a menudo son espectacularmente elevadas. Se han observado aumentos de la velocidad de 10^7 a 10^19 veces. En segundo lugar, en marcado contraste con los catalizadores inorgánicos las enzimas son su- mamente específicas para las reacciones que catalizan, y rara vez forman productos secundarios. Por último, debido a sus estructuras relativamente grandes y complejas, las enzimas pueden regularse. Esto es en particular importante en los seres vivos, que deben conservar energía y materias primas. ¿Cómo funcionan las enzimas? Para responder a esta pregunta es necesario revisar la función de los catalizadores. Por defi nición, un catalizador aumenta la velocidad de una reacción química, pero no se altera de forma permanente por la reacción. Los catalizadores realizan esta hazaña debido a que disminuyen la energía de activación que se requiere para una reacción química. En otras palabras, los catalizadores ofrecen una vía de reacción alterna que
CUADRO 6.1 Características
clave de las
enzimas
- Aumentan las velocidades de reacción
- Obedecen las leyes de la termodinámica (p. ej., no tienen efecto sobre los valores de K eq)
- Catalizan las reacciones directas y las inversas de las reacciones reversibles
- Presentes usualmente en bajas concentraciones porque no son consumidas por las reacciones
- Controladas mediante mecanismos regulatorios
- El estado de transición de los sustratos reactivos se une en los sitios activos de la enzima
Reacción sin catalizar
Estado de transición
ΔG°
Reacción catalizada
Producto Progreso de la reacción
Energía libreReactivo
ΔG
ΔG
FIGURA 6.
Un catalizador reduce la energía de activación de una reacción Un catalizador altera la energía libre de activación ∆ G ‡^ y no la energía libre estándar ∆ G ° de la reacción.
6.1 Propiedades de las enzimas 169
Sin un catalizador, el reactivo A se convierte a producto B a una determinada ve- locidad. Debido a que es una reacción reversible, B también se convierte en A. La expresión de la velocidad para la reacción directa es k F[A] n , y para la reacción inversa es k R[B] m. Los superíndices n y m representan el orden de la reacción, que refleja el mecanismo por el que A se convierte en B, y viceversa. Un orden de reacción de 2 para la conversión de A en B indica que es un proceso bimolecular y que las mo- léculas de A deben colisionar para que se produzca la reacción (sección 6.3). En el equilibrio, las velocidades de las reacciones directa e inversa son iguales:
k F[A] n^ = k R[B] m^ (1)
que se reagrupa a
k F [B] m k R [A] n (2)
El cociente de las constantes directa e inversa es la constante de equilibrio:
[B] m [A] n
K eq = (3)
Por ejemplo, en la ecuación (3), si m = n = 1 y k F = 1 × 10 −^3 s−^1 y k R = 1 × 10 −^6 s−^1 , entonces:
10 −^3
10 −^6
K eq = = 103
En el equilibrio, por lo tanto, la proporción entre los productos y los reactivos es de 1 000 a uno. En una reacción catalizada, las velocidades de reacción directa e inversa aumen- tan, pero la K eq (en este caso 1 000) permanece sin cambio. Si el catalizador aumenta tanto la velocidad directa como la inversa por un factor de 100, entonces la velocidad directa se hace 100 000, y la inversa se transforma en 100. Debido al impresionante aumento de la velocidad de la reacción directa que hace posible el catalizador, el equilibrio se alcanza en segundos o minutos, en lugar de horas o días. Es importante reconocer que la teoría del equilibrio químico supone condicio- nes ideales. Por ejemplo, las soluciones ideales contienen solutos en tan baja con- centración que no existen interacciones como la repulsión estérica o las fuerzas de atracción. Sin embargo, la mayoría de las reacciones que ocurren en solución se des - vía de la idealidad. En tales circunstancias, las constantes de equilibrio se basan no en las concentraciones de soluto, sino en actividades, cantidades llamadas con- centraciones efectivas que toman en cuenta las interacciones intermoleculares. La concentración efectiva o actividad ( a ) de un soluto es igual a:
a = c (4)
donde es un factor de corrección denominado coefi ciente de actividad , que depende del tamaño y de la carga de la especie y de la fuerza iónica de la solución en que la especie está reaccionando, y c es la concentración en moles por litro. El impacto de este fenómeno puede ser considerable. Por ejemplo, la capacidad de unión al oxíge- no de la hemoglobina, la proteína predominante en los eritrocitos, difiere en varios órdenes de magnitud dependiendo de si se mide dentro de los eritrocitos o en un amortiguador diluido. La constante de equilibrio para una reacción en condiciones no ideales está dada por:
K ºeq = B[B]/ A[A] = K ieqΓ (5)
170 CAPÍTULO 6 Enzimas
donde K ieq es la constante ideal y Γ es el factor de no idealidad, que es el cociente de los coeficientes de actividad de los productos y de los reactivos. Debe hacerse notar que los bioquímicos tradicionalmente han minimizado las interacciones inespecíficas al realizar las investigaciones de enzimas y de otras moléculas en soluciones diluidas. En el último decenio se ha hecho cada vez más evidente que es necesario reevaluar la suposición de condiciones ideales. En consecuencia, muchos investigadores usan ahora “agentes de hacinamiento” de alto peso molecular como el dextrán (un polí- mero de glucosa producido por algunas bacterias) o albúmina sérica para simular las condiciones intracelulares en los estudios enzimáticos. Los experimentos con enzimas en presencia de agentes de hacinamiento son más parecidos a aquellos en que se realizan mediciones directas in vivo , pero el ambiente del experimento sigue siendo demasiado homogéneo y difiere en grado significativo de las condiciones he- terogéneas hacinadas in vivo. Diseñar experimentos y modelos que reproduzcan las condiciones in vivo es un desafío para los bioquímicos actuales. La especificidad enzimática es una propiedad de las enzimas que se explica en parte por el modelo de llave y cerradura propuesto por Emil Fischer en 1890. Cada enzima se une a un solo tipo de sustrato debido a que el sitio activo y el sustrato poseen estructuras complementarias. La forma global del sustrato y su distribución de carga le permiten entrar e interactuar con el sitio activo de la enzima. En una variante moderna del modelo de llave y cerradura propuesta por Daniel Koshland, denominada modelo de ajuste inducido , se toma en cuenta la estructura flexible de las proteínas (fig. 6.2). En este modelo, el sustrato no se ajusta con precisión a un sitio activo rígido. En vez de ello, las interacciones no covalentes entre la enzima y el sustrato modifican la estructura tridimensional del sitio activo, adecuando la forma de éste a la del sustrato en su conformación de estado de transición. Aunque la actividad catalítica de algunas enzimas sólo depende de las interac- ciones entre los aminoácidos del sitio activo y el sustrato, otras enzimas requieren componentes no proteínicos para realizar sus actividades. Los cofactores enzimá- ticos pueden ser iones, como el Mg 2 +^ o el Zn 2 +, o moléculas orgánicas complejas denominadas coenzimas. El componente proteínico de una enzima que carece de un cofactor esencial se denomina apoenzima. Las enzimas intactas con sus cofactores unidos se denominan holoenzimas. Las actividades de algunas enzimas pueden regularse. Los ajustes de la veloci- dad de las reacciones catalizadas por las enzimas permiten a las células responder con eficacia a los cambios en el ambiente. Los organismos pueden controlar las actividades enzimáticas de forma directa, principalmente mediante la unión de ac- tivadores o inhibidores, la modificación covalente de las moléculas enzimáticas, o de manera indirecta regulando la síntesis de enzimas. (El control de la síntesis de enzimas requiere de cambios en la expresión génica, un tema que se considera en los capítulos 18 y 19.)
CONCEPTOS CLAVE
- Las enzimas son catalizadores.
- Los catalizadores modifi can la velo- cidad de una reacción debido a que proveen una vía de reacción alternati- va que requiere menos energía de ac- tivación que la reacción sin catalizar.
- La mayoría de las enzimas son proteínas.
FIGURA 6.
Modelo de ajuste inducido
La unión del sustrato produce un cam- bio conformacional de la enzima. La hexocinasa, un único polipéptido con dos dominios se muestra (a) antes y (b) después de la unión de la glucosa. Los dominios se mueven uno con rela- ción al otro para cerrarse alrededor de una molécula de glucosa (no mostrada). (a)^ (b)
172 CAPÍTULO 6 Enzimas
6. Ligasas. Las ligasas catalizan la formación de enlaces entre dos moléculas de sustrato. Por ejemplo, la DNA ligasa une fragmentos de cadenas de DNA. Los nombres de muchas ligasas incluyen el término sintetasa. Varias otras ligasas se denominan carboxilasas.
En el cuadro 6.2 se proporciona un ejemplo de cada clase de enzima.
CUADRO 6.2 Ejemplos seleccionados de enzimas
Clase enzimática Ejemplo Reacción catalizada
Oxidorreductasa Alcohol deshidrogenasa
Transferasa Hexocinasa
Hidrolasa Quimotripsina
Liasa Descarboxilasa de piruvato
Isomerasa Racemasa de alanina
Ligasa Carboxilasa de piruvato
O
CH 3 CH 2 OH NAD+ CH 3 CH NADH H+
Polipéptido + H O 2 Péptidos
CH 3 C C O^ –^ + O C CH 2
O O O
Piruvato
HCO 3 –^ – C C O
O O
Oxaloacetato
ATP ADP P (^) i
ATP
− D − Glucosa
OH HO
HO CH 2
OH
O
HO
− D − Glucosa − 6 − fosfato
OH HO
CH 2
OH
O
HO
O
O
H C
C
NH (^3)
D-Alanina
CH (^3)
O
O−
C
C H
CH (^3)
O
O−
H 3 N
L-Alanina
+ CH 3 C H
O
- CO 2 Piruvato Acetaldehído Dióxido de carbono
CH 3 O−^ H+
O
C C
O
6.2 Clasificación de las enzimas 173
El aspartame, un edulcorante artificial, tiene la siguiente estructura:
PREGUNTA 6.
Tras ser consumido en alimentos o bebidas, se degrada en el tubo digestivo en sus moléculas componentes. Mencione los productos de este proceso. ¿Qué clase de enzimas participan?
C
O
O
C
O
H CH
CH
3 N
2 N CH OCH 3
CH (^2)
H
C
O
¿Qué tipo de enzima cataliza cada una de las siguientes reacciones?
PREGUNTA 6.
CH 3 CH CH 2 CH 3 CH CH
2 C OH
O
C OH
O
H+
NAD+
NADH
(d)
CH CH (^2)
2 C OH
O
C
O
+ H
H
N CH 2 C OH
O
(^2) H N 2 H N 2
ADP
ATP
(e)
Pi
H2O
CH 3 C O CH 3 + H 2 O +
O
CH 3 C OH CH 3 OH
O
(f)
C
H (^) C HO
C
O
HO C
O
H OH
H C
C
C
O
O
C
OH H
(a)
+ HS^ CH^2 C OH
O
CH 3 S CH 2 C +
O
OH
H
H C CH (^3)
CH
2 N
3 H CH 3 N C CH 3
CH (^3)
H (b)
CH 3 CH CH 3 CH CH 2 +
OH
CH 3 H 2 O
(c)
6.3 Cinética enzimática 175
Algunas veces las reacciones de segundo orden incluyen reactivos como el agua que están presentes en gran exceso:
A + H 2 O → P La expresión de velocidad de segundo orden es: Velocidad = k [A]^1 [H 2 O]^1 (11)
Sin embargo, la reacción parece ser de primer orden debido a que el agua se encuentra presente en exceso y la [H 2 O] es en esencia constante. Estas reacciones se dice que son de seudo-primer orden. Las reacciones de hidrólisis en los sistemas bioquímicos se tratan como de seudo-primer orden debido a la sustantiva disponibilidad del se- gundo reactivo, el H 2 O, en los ambientes acuosos. Otra posibilidad es que sólo uno de los dos reactivos participe en el paso deter- minante de la velocidad y aparezca solo en la expresión de velocidad. En el ejemplo anterior, si la velocidad es igual a k [A]^2 , entonces el paso limitante de la velocidad implica colisiones entre moléculas de A. El agua participa en un paso rápido que no limita la velocidad en el mecanismo de la reacción. Cuando la adición de un reactivo no altera la velocidad de una reacción, se dice que ésta es de orden cero para dicho reactivo. En la reacción A → P, la expresión de velocidad determinada experimentalmente bajo tales condiciones es
Velocidad = k [A]^0 = k (12) La velocidad es constante debido a que la concentración del reactivo es suficien- temente elevada para saturar todos los sitios catalíticos en las moléculas enzimáticas. En el problema 6.1 se da un ejemplo para determinar el orden de reacción. El orden de reacción también puede caracterizarse de otra manera. Es posible usar un término teórico para caracterizar reacciones simples: la molecularidad se defi ne como el número de moléculas que colisionan en una reacción de un solo paso. Una reacción unimolecular A → B tiene molecularidad de uno, mientras que una reacción bimolecular A + B → C + D tiene molecularidad de dos.
CONCEPTOS CLAVE
- La cinética enzimática es el estudio cuantitativo de la catálisis de las enzimas.
- Los estudios cinéticos miden las velocidades de reacción y la afinidad de las enzimas por los sustratos y por los inhibidores.
- La cinética proporciona también conocimientos sobre los mecanismos de las reacciones.
PROBLEMA 6.
Considere la siguiente reacción:
CH 3 CH 2 OH + NAD +^ CH 3 C H + NADH + H +
O
Dados los siguientes datos de velocidad, determine el orden de cada reactivo y el orden global de la reacción. Concentraciones iniciales (mol/L) Etanol NAD+^ Velocidad (mmol/s)
1 × 102 2 × 102 2 × 102 4 × 102
Solución La expresión de velocidad inicial global es: Velocidad = k [etanol] x [NAD+] y Para evaluar x y y , determine el efecto que tiene sobre la velocidad de reacción el aumento de la concentración de un reactivo mientras se mantiene constante la concentración del otro. Para este experimento, al duplicar la concentración de etanol se duplica la velocidad de la reacción; por lo tanto, x es uno. Duplicar la concentración de NAD+^ duplica también la velocidad de la reacción, así que y también es uno. La expresión de velocidad es entonces: Velocidad = k [etanol] 1 [NAD+]^1 La reacción es de primer orden para ambos reactivos y de segundo orden en términos globales.
176 CAPÍTULO 6 Enzimas
Cinética de Michaelis-Menten Uno de los modelos más útiles en la investigación sistemática de las velocidades en- zimáticas fue propuesto por Leonor Michaelis y Maud Menten en 1913. El concepto del complejo enzima-sustrato, enunciado por vez primera por Victor Henri en 1903, es fundamental para el modelo cinético de Michaelis-Menten. Cuando el sustrato S se une al sitio activo de una enzima E, se forma un complejo intermedio (ES). Durante el estado de transición el sustrato se convierte en producto. Tras un lapso breve, el producto se disocia de la enzima. Este proceso puede resumirse así:
E + S 7 ES → E + P
k − 1
k 1 k 2
(13)
donde k 1 = constante de velocidad para la formación de ES k − 1 = constante de velocidad para la disociación de ES k − 2 = constante de velocidad de la formación del producto y su liberación del sitio activo La ecuación (13) ignora la reversibilidad del paso en el que el complejo ES se convier- te en enzima y producto. Se permite esta simplificación si la velocidad de reacción se cuantifica cuando la [P] es aún muy baja. Recuérdese que en la mayoría de los estudios cinéticos se determinan las velocidades iniciales. Además, muchas enzimas tienen poca afinidad por el producto, de modo que es poco probable la reacción inversa. Según el modelo de Michaelis-Menten, tal como se concibe en la actualidad, se asume que (1) k − 1 es despreciable en comparación con k 1 , y (2) la velocidad de forma- ción de ES es igual a la velocidad de su degradación durante la mayor parte del curso de la reacción (p. ej., [ES] permanece igual durante toda la reacción). Esta última premisa se denomina suposición del estado estacionario de equilibrio dinámico. La expresión general de la velocidad de reacción es
Velocidad = = k 2 [ES]
∆P
∆ t (14) Para que sea de utilidad, la velocidad de una reacción debe definirse en términos de [S] y [E]. La velocidad de formación de ES es igual a k 1 [E][S], mientras que la velocidad de disociación de ES es igual a ( k − 1 + k 2 )[ES]. La suposición del estado estacionario iguala estas dos velocidades: k 1 [E][S] = ( k − 1 + k 2 )[ES] (15)
[ES] =
[E][S]
( k –1+ k 2 )/ k 1 (16)
Michaelis y Menten introdujeron una nueva constante, K m (conocida como constante de Michaelis ):
k m =
k –1+ k 2 k 1 (17) También derivaron la ecuación:
v =
V máx [S] [S] + Km (18)
donde V máx = velocidad máxima que puede alcanzar la reacción. Esta ecuación, co- nocida ahora como ecuación de Michaelis-Menten , ha demostrado ser muy útil para defi nir determinados aspectos del comportamiento enzimático. Por ejemplo, cuando [S] es igual a K m, el denominador de la ecuación (18) es igual a 2[S], y v es igual a V máx/2 (fi g. 6.4). El valor de K m determinado experimentalmente (medido en moles por litro de sustrato) se considera una constante que es característica de la enzima y el sustrato en condiciones específicas. Puede reflejar la afinidad de la enzima por su sustrato. (Si k 2 es mucho menor que k –1, es decir, k 2 << k –1, entonces el valor de K m se aproxima a k 1. En estas circunstancias, K m es la constante de disociación del complejo ES.) Cuanto menor es el valor de K m, menor es la [S] requerida para llegar a 1/2 Vmáx y, por lo tanto, mayor es la “afinidad” de la enzima por el sustrato.
FIGURA 6.
Velocidad de reacción inicial v 0 y concentración de sustrato [S] para una reacción típica catalizada por una enzima
La enzima tiene la mitad de la velo- cidad máxima a la concentración del sustrato K m.
ν 0
[S]
Km
Vmáx
Vmáx 2
0
178 CAPÍTULO 6 Enzimas
La actividad enzimática se expresa en unidades internacionales (UI). Una UI se defi ne como la cantidad de enzima que produce 1 mol de producto por minuto. La actividad específi ca de una enzima, una magnitud que se utiliza para supervisar la purifi cación de la enzima, se define como el número de unidades internacionales por miligramo de proteína. [Recientemente se introdujo una nueva unidad de medida de la actividad enzimática, denominada katal. Un katal (kat) indica la cantidad de enzi- ma que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Un katal es igual a 6 × 10 7 UI.]
Gráfi cas de Lineweaver-Burk Los valores de K m y V máx para una enzima se determinan cuantificando las velocida- des iniciales de la reacción a varias concentraciones de sustrato. Se pueden obtener valores aproximados de K m y V máx construyendo una gráfica como la de la figura 6.4. Con una transformación algebraica de los datos se puede derivar una determinación más exacta de esos valores. La ecuación de Michaelis-Menten, cuya gráfica es una hipérbola,
v =
V máx[S] [S] + Km
puede reordenarse obteniendo su expresión recíproca:
= +
1 K m 1 1 v 0 V máx [S] V máx
CUADRO 6.3 Valores de kcat, Km y kcat/Km de enzimas seleccionadas
Enzima Reacción catalizada k cat(s −^1 ) K m(M) k cat/ K m (M −^1 s −^1 )
Acetilcolinesterasa 1.4 × 10 4 9 × 10 −^5 1.6 × 108
Anhidrasa carbónica (^4) × 10 5 0.026 1.5 × 10 7
Catalasa (^4) × 10 7 1.1 4 × 10 7
Fumarasa 8 × 10 2 5 × 10 −^6 1.6 × 108
Triosafosfato isomerasa 4.3 × 10 3 4.7 × 10 −^4 2.4 × 108
Fuente : Adaptado de A. Fersht, Structure and Mechanism in Protein Science: A Guide to Enzyme Catalysis and Protein Folding, 2nd ed., W. H. Freeman, New York, 1999.
H 2 O
CH 3 C O +
O
HO CH 2 +
CH 2 CH (CH (^3)
O H C 3 C O ) 3
H+
Acetilcolina
2 N
CH 2 N+(CH 3 ) (^3) Acetato Colina HCO− 3 + H+^ CO 2 + H 2 O
2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2
CH +^ H^2 O
O
O
CH
O
O
Fumarato
Malato
OH
2
OH
O H C CH P O
O
Gliceraldehído–3–fosfato
Dihidroxiacetona fosfato
CH (^2)
O–
HO CH 2 CH (^2)
O C
O
P O
O
O–
O
6.3 Cinética enzimática 179
Se trazan los recíprocos de las velocidades iniciales frente a los recíprocos de las concentraciones de sustrato. En una gráfica de estas características, conocida como gráfi ca de dobles recíprocos de Lineweaver-Burk , la línea recta que se genera tiene la forma y = mx + b , donde y y x son variables (1/ v y 1/[S], respectivamente) y m y b son constantes ( K m/ V máx y 1/ V máx, en el mismo orden). La pendiente de la línea recta es K m/ V máx (fi g. 6.6). Como se indica en la figura 6.6, la intercepción sobre el eje vertical es 1/ V máx. La intercepción sobre el eje horizontal es −1/ K m. El siguiente es un ejemplo de un problema de cinética que utiliza la gráfica de Lineweaver-Burk.
PROBLEMA 6.
Considere la gráfica de Lineweaver-Burk de la figura 6.7. Identifique: a. −1/ K m b. 1/ V máx c. K m/ V máx
Solución a. A = −1/ K m b. B = 1/ V máx c. K m/ V máx = pendiente
Reacciones de sustratos múltiples
La mayoría de las reacciones bioquímicas implican dos o más sustratos. La reacción de sustratos múltiples (o multisustrato) más común, la reacción de dos sustratos, se representa como:
A + B 7 C + D
En la mayoría de estas reacciones ocurre la transferencia de un grupo funcional específico desde un sustrato hacia el otro (p. ej., grupos fosfato o metilo), o bien se realizan reacciones de oxidación-reducción en las que las coenzimas redox (p. ej., NAD+/NADH o FAD/FADH 2 ) son los sustratos. El análisis cinético de reacciones de dos sustratos es por necesidad más complicado que el de las reacciones con un sustra- to. Sin embargo, para la mayoría de los casos a menudo basta con la determinación de la K m para cada sustrato (cuando el otro está presente en cantidades de saturación). Con base en el análisis cinético, las reacciones multisustrato pueden dividirse en dos clases: secuenciales y de doble desplazamiento.
REACCIONES SECUENCIALES Una reacción secuencial no puede proceder sino hasta que todos los sustratos se han unido al sitio activo de la enzima. Existen dos mecanismos secuenciales posibles: el ordenado y el aleatorio. En un mecanismo ordenado de dos sustratos, el primer sustrato debe unirse a la enzima antes que el segundo para que la reacción proceda hasta la formación de producto. La notación para tales reacciones, creada por W. W. Cleland, es
En un mecanismo secuencial aleatorio, los sustratos pueden unirse en cualquier orden y los productos se pueden liberar en cualquier orden.
E EA (EAB) (ECD) ED E
A B C D
FIGURA 6.
Gráfi ca de Lineweaver-Burk o de los dobles recíprocos Si una enzima obedece la cinética de Michaelis-Menten, una gráfica del recíproco de la velocidad de reacción 1/ v 0 como función del recíproco de la concentración de sustrato 1/[S] se ajus- ta a una línea recta. La pendiente de la línea es K m/ V máx. La intersección con el eje vertical es 1/ V máx y la intersección con el eje horizontal es −1/ K m.
FIGURA 6.
Gráfi ca de Lineweaver-Burk
B
A 1 [S]
v 0
1
0
Pendiente = Km Vmáx
1 [S]
v 0
1
(^1) V máx
−^1 Km
6.3 Cinética enzimática 181
El sustrato y el inhibidor compiten por el mismo sitio en la enzima. Tan pronto como el inhibidor se une, el acceso del sustrato al sitio activo queda bloqueado. La concentración del complejo EI depende de la concentración del inhibidor libre y de la constante de disociación K I:
K I = =
[E][I] k I− 1 [EI] k I
donde K I es una medida de la afinidad de unión de la enzima al inhibidor. Debido a que el complejo EI se disocia con facilidad, la enzima queda disponible de nuevo para unirse con el sustrato. En presencia de un inhibidor competitivo, la ac- tividad de la enzima disminuye al aumentar K m, sin que cambie V máx (fi g. 6.8), porque el complejo EI no participa en el proceso catalítico. Como V máx no cambia, el efecto de un inhibidor competitivo sobre la actividad se revierte al aumentar la concentra- ción de sustrato. A [S] elevadas, todos los sitios activos se llenan con el sustrato y la velocidad de reacción alcanza el valor que se observa sin el inhibidor. La ecuación de Michaelis-Menten para la inhibición competitiva que toma en cuenta la formación de [EI] se obtiene incorporando un término para el efecto del inhibidor sobre K m:
v =
V máx[S] [S] + K m
donde = 1 +[I]/ K i. El término es una función tanto de la concentración del inhibidor competitivo como de su afinidad por el sitio activo de la enzima. El valor de K m (la [S] a la que v = 1/2 V máx) aumenta de manera proporcional al factor en presencia del inhibidor. Al término K m se le llama a menudo K m aparente ( K map). Las sustancias que se comportan como inhibidores competitivos (p. ej., reducen la afi nidad aparente de una enzima por el sustrato) suelen tener una estructura semejante a la del sustrato. Entre estas moléculas hay productos de la reacción, análogos del sustrato que no se metabolizan o derivados del sustrato. La succinato deshidrogenasa, una enzima del ciclo de Krebs del ácido cítrico (cap. 9), cataliza una reacción redox que convierte el succinato en fumarato.
Esta reacción es inhibida por el malonato (fig. 6.9). Éste se une al sitio activo de la enzima, pero no puede ser convertido en producto. Las moléculas que semejan una estructura del estado de transición de un sustrato, conocidas como análogos del estado de transición , pueden ser inhibidores competitivos especialmente eficientes. Se unen al sitio activo de la enzima con mayor afinidad que el sustrato. El oselta- mivir, que se usa para prevenir y tratar la influenza, se convierte en el hígado como un análogo del estado de transición del ácido siálico (un azúcar de nueve carbones). La unión del oseltamivir al sitio activo de la enzima viral neuraminidasa inhibe la escisión del ácido siálico de ciertas proteínas celulares anfitrionas, impidiendo con ello la liberación de nuevos virus desde las células infectadas.
INHIBIDORES NO COMPETITIVOS En algunas reacciones catalizadas por enzimas el inhibidor puede unirse tanto a la enzima libre como al complejo enzima-sustrato:
FIGURA 6.
Gráfi ca de Michaelis-Menten de actividad enzimática sin inhibir comparada con inhibición competitiva La velocidad inicial v 0 se grafica contra la concentración de sustrato [S]. Con la inhibición competitiva, la V máx perma- nece constante y la K m aumenta.
ν 0
[S]
Km
Vmáx Sin inhibir
competitivo
Con un inhibidor
Kmi
FIGURA 6.
Malonato
C O−
O
CH 2
C O−
O
O
C O –
CH (^2)
CH (^2)
C O –
O
O
C O–
C
C
C (^) O–
O
H
H 2 H
[O]
Succinato Fumarato
182 CAPÍTULO 6 Enzimas
En estas circunstancias, que se denominan inhibición no competitiva , el inhibidor se une a un lugar distinto del sitio activo. La unión del inhibidor ocasiona una modifica- ción en la conformación de la enzima, lo que impide la formación del producto (fig. 6.10). Los inhibidores no competitivos tienen escasa o nula semejanza estructural con el sustrato, pero pueden influir en la unión del sustrato si sus sitios de unión están en estrecha cercanía con el sitio de unión del sustrato. En algunos casos la inhibición no competitiva se revierte en parte aumentando la concentración de sustrato. El análisis de las reacciones inhibidas por inhibidores no competitivos a menudo es complejo porque suelen participar dos o más sustratos. De esta forma, las características de inhibición que se observan pueden depender en parte de factores como el orden en que se unen los diferentes sustratos. Además, para la unión de los inhibidores no competitivos existen dos determinaciones de K I.
E
I
I
EI + S (^) EIS kI–
kI–1 kI 1 kI 1
kI–1 kI 1
Dependiendo del inhibidor que se considere, los valores de estas constantes de di- sociación pueden ser o no equivalentes. Existen dos formas de inhibición no com- petitiva: la pura y la mixta. En la inhibición no competitiva pura (el inhibidor se une lejos del sitio activo), que es un fenómeno poco frecuente, ambos valores de K I son equivalentes. La inhibición no competitiva mixta (el inhibidor se une cerca del sitio activo) es en general más complicada debido a que los valores de K I son diferentes. La ecuación de Michaelis-Menten que describe la inhibición no competitiva mixta es
v =
V máx[S] ′[S] + Km
donde = 1 +[I]/ K Ia y ′ = (1+[I]/ K Ib). En la inhibición no competitiva pura (p. ej., = ′) los valores de V máx cambian, pero la K m permanece igual. En la inhibición no competitiva mixta se alteran los valores de ambos, K m ( K map^ = / ′ K m) y V máx ( V máxap^ = V máx/ ′).
INHIBIDORES ACOMPETITIVOS En la inhibición acompetitiva, que se considera un tipo poco frecuente de inhibición no competitiva, el inhibidor sólo se une al complejo enzima-sustrato, y no a la enzima libre. En consecuencia, el inhibidor es ineficaz a bajas concentraciones de sustrato porque hay muy poco complejo ES presente.
La constante de disociación para el paso de unión de un inhibidor acompetitivo a una enzima es
La inhibición acompetitiva se observa más fácilmente a una [S] alta. Cuando I se une al ES, el sustrato no queda libre para disociarse de la enzima y la K m ( K map^ = K m/ ′)
[E][I] [EI]
Kla =
[E][S][I] [EIS]
Klb =
y
K′ I = ESI
[ ][ ] [ E S (^) I]
E
I
EIS
kI–1 kI 1
FIGURA 6.
Gráfi ca de Michaelis-Menten de actividad enzimática sin inhibir comparada con inhibición no competitiva
Se representa la velocidad inicial v 0 frente a la concentración de sustrato [S]. Con la inhibición no competiti- va, V máx desciende y K m permanece inalterada si el acceso al sitio activo no está obstruido. Si el sitio activo está bloqueado parcialmente cuando el inhi- bidor está unido, la K m aumenta.
v 0
[S]
Km
Vmáxi
Vmáx Sin inhibir
Sin un inhibidor competitivo
184 CAPÍTULO 6 Enzimas
recíproco como un desplazamiento de la intercepción horizontal.) En la inhibición no competitiva pura (p. ej., K Ia = K Ib), V máx disminuye (p. ej., la intercepción vertical se desplaza); en este caso poco frecuente la K m no cambia porque los valores de k para la unión a la E y al complejo ES son los mismos. En la inhibición no competitiva mixta, estos valores de k difi eren porque el sitio de unión del inhibidor está muy cerca del sitio activo y sus actividades de unión se interfieren mutuamente. En consecuencia, cambian V máx y K m. En tales casos las gráficas de 1/ v contra 1/[S] se intersecarán a la izquierda del eje vertical ya sea arriba del eje horizontal si K I′ es mayor que K I, o abajo del eje si K I′ es menor que K I. En la inhibición acompetitiva cambian tanto K m como V máx, aunque su cociente (p. ej., la pendiente K m / V máx) permanece igual.
INHIBICIÓN IRREVERSIBLE En la inhibición reversible el inhibidor puede disociar- se de la enzima debido a que se une mediante enlaces no covalentes. Los inhibidores irreversibles usualmente se unen de forma covalente a la enzima, con frecuencia a la cadena lateral de un residuo de aminoácido del sitio activo. Por ejemplo, las enzimas que contienen grupos sulfhidrilo libres pueden reaccionar con agentes alquilantes como el yodoacetato:
CONCEPTOS CLAVE
- La inhibición reversible de enzimas puede ser competitiva, no competitiva o acompetitiva.
- Los inhibidores competitivos compi- ten con el sustrato por el mismo sitio en la enzima libre de forma reversi- ble.
- Los inhibidores no competitivos pueden unirse tanto a la enzima como al complejo enzima-sustrato porque se unen a un sitio distinto del sitio activo.
- Los inhibidores acompetitivos sólo se unen al complejo enzima-sustrato y no a la enzima libre.
- Los inhibidores irreversibles suelen unirse de modo covalente a la enzima.
La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, una enzima de la vía glucolítica (cap. 8), se inactiva mediante alquilación con yodoacetato. Las enzimas que utilizan grupos sulfhidrilo para formar enlaces covalentes con cofactores metálicos con frecuencia son inhibidos en forma irreversible por metales pesados (p. ej., el mercurio y el plomo). La anemia que es sintomática de envenenamiento por plomo se produce en parte por la unión de éste a un grupo sulfhidrilo de la ferroquelatasa. Ésta cataliza la inserción de Fe^2 +^ en el grupo prostético hemo de la hemoglobina. El problema 6.4 está relacionado con la inhibición enzimática.
+ CH 2 C
O
CH 2 C O− O−
O
Enzima CH 2 SH I Enzima CH 2 S + HI
PROBLEMA 6.
Considere la gráfica de Lineweaver-Burk de la figura 6.12.
Línea A = reacción catalizada por enzima normal Línea B = adición del compuesto B Línea C = adición del compuesto C Línea D = adición del compuesto D Identifíquese el tipo de acción inhibitoria de los compuestos B, C y D.
Solución El compuesto B es un inhibidor competitivo porque sólo cambió la K m. El compuesto C es un inhibidor no competitivo puro porque sólo cambió la V máx. El compuesto D es un inhibidor acompetitivo porque cambia tanto la K m como la V máx.
B C
A
1 [S]
v 0
1
D FIGURA 6.
Gráfi ca de Lineweaver-Burk
6.3 Cinética enzimática 185
ENZIMAS ALOSTÉRICAS Aunque el modelo de Michaelis-Menten es una herra- mienta inestimable, no explica las propiedades cinéticas de muchas enzimas. Por ejemplo, las gráficas de velocidad de reacción frente a concentración de sustrato de muchas enzimas con varias subunidades son a menudo sigmoideas en lugar de hiper- bólicas, como lo predice el modelo de Michaelis-Menten (fig. 6.13). Estos efectos se ven en un grupo importante de enzimas denominadas enzimas alostéricas. Obsér- vese que la curva de unión del sustrato de la figura 6.13 se parece a la curva de unión del oxígeno a la hemoglobina. Las propiedades de las enzimas alostéricas se discuten más adelante en este capí- tulo.
PROBLEMA 6.
Una enzima tiene una K m de 10 M. Cuando se agregan 5 M de un inhibidor com- petitivo, se encuentra que la K 1 es 2.5 M. Determine a) el valor de , y b) K map.
Solución a. El valor de se determina como sigue:
= 1 + [I]/ K I = 1 + 5 M/2.5 M = 1 + 2 = 3
b. K map, el valor de la medición de K m cuando se inhibe la enzima, se calcula como sigue:
= K map/ K m K map^ = K m = (3)(10 mM) = 30 mM
Beber metanol puede producir ceguera en el ser humano, así como acidosis grave potencialmente letal. El metanol es tóxico porque es convertido a formaldehído y ácido fórmico en el hígado por las enzimas alcohol deshidrogenasa y aldehído deshi- drogenasa. El envenenamiento con metanol se trata por medio de diálisis e infusiones de bicarbonato y de etanol. Explique por qué se utiliza cada tratamiento.
PREGUNTA 6.
La yodoacetamida es un inhibidor irreversible de varias enzimas que tienen un re- siduo de cisteína en sus sitios activos. Tras examinar su estructura, pronostíquese el producto de la reacción de la yodoacetamida con una enzima así.
PREGUNTA 6.
I CH 2 C NH (^2)
O
FIGURA 6.
Perfi l cinético de una enzima alostérica La curva de unión sigmoidea que pre- sentan muchas enzimas alostéricas se asemeja a la curva de unión cooperativa del O 2 a la hemoglobina.
v 0
[S]
Vmáx
