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Bacillus Thuringiensis

Bioquimica

Leidy Andrea Reyes – Paula Alejandra Parra – Laura Paola López

Tabla de Contenido

• Que es el Bacillus Thuringiensis?
• Características generales
• Cristales Paraesporales
• Mecanismos de acción
• Corpúsculo basal
• Proteinas Cry
• Factores genéticos
• Genoma
• Genes codificantes de proteínas insecticidas cry
• Bacteria Grampositiva
• Uso en control de plagas
• Bibliografia

El Perú es uno de los 7 países con mayor diversidad biológica del mundo, es una zona endémica de enfermedades metaxénicas como fiebre amarilla, malaria, dengue. El dengue, es la enfermedad viral humana más importante en salud pública, transmitida por mosquitos del género Aedes principalmente A. aegypti. Ésta se ha ido extendiendo a varios países, en especial a los de las regiones tropicales y subtropicales por lo que se le considera como una de las principales enfermedades reemergentes y emergentes a escala mundial.

A nivel continental se ha descrito el potencial mosquitocida de cepas de Bacillus thuringiensis aislados de diversos agroecosistemas, han estandarizado medios de cultivo para su producción y evaluado su actividad biolarvicida.

Es importante el control de insectos plaga que dañan nuestra agricultura, explorar la presencia y diversidad de cepas de Bacillus thuringiensis, caracterizarlas molecularmente para utilizarlas como fuentes de nuevos genes cry, lo cual proporcionará información sobre los patrones de distribución ecológicos de la bacteria y la oportunidad de seleccionar cepas para elaborar bioinsecticidas para controlar diversas plagas y vectores de enfermedades metaxénicas, debido al impacto económico que muchas plagas ocasionan a ciertas plantaciones y a la economía del país y por los problemas de salud que significan muchas enfermedades relacionadas con vectores.

Por ello, el objetivo del presente trabajo, fue la caracterización molecular de genes cry genómico y plasmidial de cepas nativas de B. thuringiensis aisladas de diferentes regiones del Perú, y evaluar su toxicidad por medio del bioensayo en larvas de mosquitos del género Aedes, dada su prevalencia en nuestro medio, con la idea de plantear a las autoridades respectivas el control de plagas y vectores mediante el uso de B. thuringiensis como bioinsecticida.

Características generales

Bacillus thuringiensis es una bacteria Gram positiva, aerobia estricta, de flagelación peritrica, que mide de 3 a 5 μm de largo por 1 a 1,2 μm de ancho, posee como característica distintiva la capacidad de sintetizar y acumular proteínas denominadas Cry y depositarlas como cristales paraesporales durante la fase estacionaria de su ciclo de crecimiento y de desarrollar esporas de resistencia elipsoidales que no provocan el hinchamiento del perfil bacilar. Es un microorganismo quimioorganotrofo y con actividad de catalasa, las distintas cepas de Bacillus thuringiensis poseen la capacidad de fermentar glucosa, fructosa, trehalosa, maltosa y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno, esculina y N- acetil-glucosamina.

Durante su ciclo de vida presenta dos fases diferenciadas, la fase de crecimiento vegetativo en la cual las bacterias se duplican por bipartición y la fase de esporulación que se desencadena cuando la bacteria se encuentra en un medio con limitación de nutrientes; el proceso de formación de la espora se puede dividir en siete fases: en la fase I se inducen los genes que darán inicio a la esporulación, la adición de nutrientes en esta fase puede revertir el proceso; en la fase II se forma un septo de división asimétrico, a partir de esta fase el proceso es irreversible; en la fase III, se inicia la síntesis del cristal y continuará su maduración hasta el final de la esporulación. La síntesis del cristal se da a partir de dos promotores que funcionan secuencialmente, BTI y BTII. El primero es reconocido por σA durante las fases III y IV y el segundo por σK durante las fases V y VI. Durante estos pasos ocurre conjuntamente la formación de la espora. Finalmente en la fase VII se sintetizan enzimas líticas que liberan a las esporas y los cristales del compartimento. La fase de esporulación se caracteriza por la formación de cristales o cuerpos paraesporales intracelulares de naturaleza proteica a los cuales se les ha denominado proteínas Cry, estas proteínas cristal que presentan actividad insecticida, están codificadas por genes cry localizados en plásmidos.

Las proteínas Cry de los cristales paraesporales de Bacillus thuringiensis son protoxinas que cuando son ingeridas por las larvas de los insectos susceptibles, les causan intoxicación. Las condiciones alcalinas del intestino medio de la larva y su procesamiento proteolítico, catalizado por diferentes proteasas de la larva disuelven los cristales y activan las protoxinas convirtiéndolas en toxinas. La toxina activa es conocida como δ- endotoxina, la cual se une a receptores específicos presentes en las células del epitelio intestinal del insecto hospedero formando poros o canales iónicos en la membrana. Esto provoca la lisis osmótica que conduce a la parálisis y muerte, por inanición, de la larva.

Bacillus thuringiensis es considerado una bacteria cosmopolita en el ambiente, distribuida ampliamente en todo el mundo debido a su capacidad esporulante, lo que le confiere una elevada resistencia al calor y a la sequedad, se le ha aislado

La gran diversidad de combinaciones de genes de δ-endotoxinas existentes se debe principalmente a que éstos están situados principalmente en plásmidos transmisibles por conjugación entre cepas y su secuencia está frecuentemente flanqueada de elementos transponibles, lo que posibilita su transmisión horizontal.

El Bacillus thuringiensis tiene una gran variedad de cepas con diferente potencial tóxico de acuerdo a las regiones donde son aisladas.

Cristales Paraesporales

Desde el instante en el que ocurre el englobamiento de la pre-espora hasta su maduración; simultánea a la formación de la espora, Bacillus thuringiensis sintetiza una o varias inclusiones cristalinas que pueden representar hasta un 30% del peso seco del esporangio y que son fácilmente observables bajo microscopio de contraste de fase. Este cristal está separado de la endospora y es liberado cuando la pared celular se autolisa al final de la esporulación.

Cada cuerpo de inclusión puede estar constituido por proteínas Cry de una o varias clases que se agrupan entre sí mediante puentes disulfuro. La estabilidad de estas uniones condiciona el pH de solubilización del cristal. Particularmente en el caso de los cristales bipiramidales, cuando estos puentes están distorsionados, estos cristales son solubles a pH mayor de 9,5; mientras que si permanecen en su estado más estable necesitan un pH superior a 12 para lograr su solubilidad. La estructura de esta inclusión es el resultado del ensamblaje de varias unidades polipeptídicas de diferentes pesos moleculares, que oscilan entre 27 y 140 kDa, las cuales le dan su forma característica.

Las cepas de B. thuringiensis pueden presentar cristales con distintas morfologías y pueden clasificarse en bipiramidales, relacionado con Cry1; cúbicos, asociados con Cry2; cuadrados aplanados, típicos de Cry3; esféricos y otras formas atípicas menos frecuentes, relacionadas con Cry4 y Cyt; en forma de barra, relacionada con Cry4D.

Se logró en muchos casos establecer relación entre la forma del cristal, sus proteínas Cry constituyentes, el peso molecular de éstas y su espectro de actividad insecticida. Sin embargo, existen trabajos en los que se describieron cristales parasporales que, a pesar de tener morfologías asociadas a una toxicidad específica, no parecen poseer actividad insecticida alguna. El cristal parasporal se ubica en el interior del esporangio y, por lo general, fuera del exosporio de la espora, y ambos son finalmente liberados tras la lisis celular. Existen algunos casos donde se describieron cristales dentro del exosporio, por lo que estos continúan junto a las esporas tras la lisis. En otro caso muy atípico, se pudo

observar que los cristales se forman fuera del exosporio, pero ambos permanecen indefinidamente dentro de un esporangio que no se lisa, preservándolos de una rápida degradación.

Las diferentes toxinas producidas por B. thuringiensis reconocidas actualmente son, la α-exotoxina o fosfolipasa Ct, la exotoxina, una toxina lábil, una toxina soluble en agua, la exotoxina factor ratón, la β-exotoxina y la δ- exotoxina, de las cuales las dos últimas son las más estudiadas por su acción tóxica contra larvas de insectos.

Los cristales paraesporales son ampliamente utilizados para la elaboración de bioinsecticidas, lo que ha motivado el estudio y la búsqueda de proteínas Cry. Esto ha permitido establecer la existencia de más de 200 proteínas Cry.

La inclusión de una nueva proteína Cry en este grupo depende del cumplimiento de algunas características, tal como su acumulación en la célula mediante un cristal paraesporal y el presentar similitud a nivel de secuencia de aminoácidos con alguna de las proteínas Cry existentes; además de contar con actividad tóxica frente a algún organismo.

Las proteínas Cry pueden agruparse dentro de distintos grupos de homología, ellas poseen tres dominios altamente conservados; el dominio I ha sido implicado en la formación del poro mediante la inserción de sus α - hélices en la membrana de las células epiteliales; el domino II juega un papel importante en la interacción con el receptor membranal y es el responsable de la toxicidad específica; el dominio III está involucrado en la unión al receptor y adicionalmente tiene un rol en la formación del poro. Por otra parte, existen grupos de homología minoritarios formados por proteínas que se depositan como cristales en la bacteria, pero carecen de los tres dominios conservados de las proteínas Cry. Adicionalmente, existen proteínas que se depositan como inclusiones cristalinas en la bacteria, pero carecen de actividad tóxica, motivo por el cual no son consideradas del grupo de proteínas Cry.

Mecanismos de acción

El modo de acción de las toxinas Cry fue descrito en lepidópteros como un proceso de múltiples etapas. Las proteínas cristal son sintetizadas como protoxinas las cuales son liberadas luego de ser ingeridas por larvas susceptibles y solubilizadas en el medio alcalino (pH 10-12) del intestino medio de la larva del insecto. Estas deberán ser cortadas en sitios específicos por proteasas intestinales para generar fragmentos de toxinas activas resistentes a proteasas, de 60-70 kDa que causaran la muerte de la larva.

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Los cristales paraesporales se clasifican como endoesporas bacterianas, estos son cristales octaédricos ,bipiramidales, formados por la agregación regular de subunidades de una glucoproteína de 120 KD ,proteínas Cry, estas se forman en la célula madre durante la cuarta fase de la esporulación en algunas especies de Bacillus thuringiensis. Han encontrado gran variedad caracterizada por su serotipo flagelar H (proteínas presentes en el flagelo), posee más de 200 genes cry, responsables de la actividad insecticida. Las proteínas tóxicas, protoxinas, para los diferentes órdenes de larvas de insecto se muestran a continuación.

Ordenes de larva Ejemplo Grupo de proteína toxica Lepidópteros Polillas y mariposas Cry 1, Cry2 , Cry 9 Coleópteros Escarabajos Cry 3, Cry 7, Cry 8 Nematodos Invertebrados Cry 5, Cry 12, Cry 13, Cry 14 Dípteros Moscas y mosquitos Cry 2, Cry 4, Cry 10, Cry 11, Cry 16, Cry 17, Cry 19

Los subgrupos Cry 1 B y Cry 1 I, tienen actividad dual contra lepidópteros y coleópteros Estas no presentan afectación en los mamíferos ni tampoco un impacto ambiental fuerte, por lo que el uso de esta bacteria para los insecticidas es clasificado como ecológico, a diferencia de insecticidas químicos, que si representan un daño ecológico.

Proteínas Cry

La estructura proteica está constituida por tres dominios Dominio I: consta de un paquete de siete α-hélices anti paralelas, donde la hélice 5 está rodeada por las demás. Es el responsable de la formación del poro, el cual se cree que adquiere su forma final de poro por acción de las hélices α5 y α6 que se juntan en forma de bucle en el extremo de la estructura insertándose en la superficie de la membrana lipídica de las células intestinales del insecto susceptible. Dominio II: consta de tres láminas antiparalelas β distribuidas en una típica topología de “llave griega”, acomodada en lo que se ha llamado un β-prisma. Debido a que la conformación de las láminas β, son parecidas con regiones de unión antígeno-anticuerpo en otras proteínas, y a su relación con las Lectinas, se considera que esta zona reconoce el receptor de superficie en la membrana apical

del intestino del organismo que es sensible a estas toxinas. Este dominio es una zona muy variable por lo que esta determina la especificidad, ya que es la principal encargada del reconocimiento al receptor del insecto. Dominio III: Este consta de 2 láminas β antiparalelas formando un β sándwich (12-14). Esta mantiene la estructura de la toxina frente al ataque de las proteasas, reconoce al receptor junto con el dominio II y ayuda en la formación del poro lítico.

Estructura primaria: consta de 5 bloques conservados. Bloque 1: se compone de 5 hélices del dominio I , zona muy conservada encargada de la formación del poro Bloque 2: está formada por 7 hélices del dominio I y la primera lámina β del dominio II Los bloque 3,4 y 5 se encuentran dentro del dominio III Bloque 3: tiene la última lámina β del dominio II, una estructura involucrada en las interacciones entre los dominios II y III Bloque 4: contiene 2 argininas centrales envueltas en los puentes salinos, involucrados en la agregación oligomérica Bloque 5: la razón bilógica no ha sido determinada Receptores: Caderinas, Aminopeptidasa N (APN), Fosfatasa alcalina y proteínas de 210 kDa.

Factores genéticos

Genoma

Las cepas de B. thuringiensis tienen un genoma de 2.4 Mb a 5.4-6.3 Mb. La comparación del genoma de B. thuringiensis con el mapa cromosomal de B. cereus ha demostrado que los cromosomas tienen una organización similar en la mitad cerca al origen de replicación mientras que presentan mayor variabilidad en la otra mitad terminal. La mayoría de cepas de B. thuringiensis exhiben usualmente un complejo perfil de plásmidos circulares y lineales cuyos tamaños varían desde 2 hasta mas de 200 kb. Los genes cry que codifican las toxinas Cry están principalmente localizados en grandes plásmidos conjugativos. Existe la idea generalizada de que los genes cry siempre se localizan en plásmidos de alto peso molecular, generalmente con un tamaño superior a 30 kb y con replicación tipo theta. Sin embargo algunos autores los han descrito de bajo peso molecular y también han reportado la existencia de genes cry insertados en el cromosoma de B. Thuringiensis menciona que no se ha reportado la presencia de genes cry en plásmidos pequeños menores de 15 kb.

En microbiología, se denominan bacterias grampositivas, o bacterias Gram- positivas, aquellas bacterias que se tiñen de azul oscuro o violeta por la tinción de Gram. Esta característica química está íntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo que refleja un tipo natural de organización bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como taxón se utiliza también el nombre de Posibacteria. Las restantes son las bacterias gramnegativas.

La envoltura celular de las bacterias grampositivas comprende la membrana citoplasmática y una pared celularcompuesta por una gruesa capa de peptidoglucano, que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmática mediante moléculas de ácido lipoteicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tinción de Gram. A diferencia de las bacterias grampositivas, las gramnegativas presentan una segunda membrana lipídica externa a la pared celular.

Incluyen especies tanto móviles (vía flagelos) como inmóviles con forma de bacilo (Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco ( Staphylococcus, Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas ( Mycoplasma). Algunas especies son fotosintéticas, pero la mayoría son heterótrofas. Muchas de estas bacterias forman endosporas en condiciones desfavorables. Realmente, no todas las bacterias del grupo son grampositivas (no se tiñen por la aplicación de ese método), pero se incluyen aquí por su similitud molecular con otras bacterias grampositivas.

Uso en control de plagas

Desde 1920 se han utilizado las esporas y los cristales de proteína insecticidas producidos por B. thuringiensis en el control de plagas. Actualmente se utilizan como insecticidas específicos bajos nombres comerciales como Bioster, Dipel y Thuricide. Estos plaguicidas son considerados respetuosos con el medio ambiente por su especificación, ya que su efecto sobre los humanos, sobre la vida silvestre , sobre los polinizadores y sobre muchos otros insectos beneficiosos es mínimo o casi nulo. La compañía belga Plant Genetic Sistems fue la primera (en 1985) en desarrollar plantas genéticamente modificadas (tabaco) con tolerancia a los insectos mediante la expresión de los genes Cry de B. thuringiensis. A menudo, los insecticidas basados en B. thuringiensis que se aplican como spray líquido en plantas de cultivo deben ser ingeridos para tener efecto. Cuando los insectos ingieren los cristales proteicos, el pH alcalino de su tracto digestivo activa la toxina Cry, la cual se inserta en el epitelio del intestino del insecto, provocando poros en

el epitelio. El poro causa una lisis celular (rotura de la membrana celular) y la posterior muerte del insecto. Bacillus thuringiensis serotipo israelensis, una cepa de Bt que se emplea ampliamente como larvicida contra los mosquitos, también se considera un método para controlar la población de mosquitos respetuoso con el medio ambiente.

Bibliografía

• http://www.scielo.org.co/pdf/nova/v11n20/v11n20a09.pdf
• http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/3513/1/Huerta_cd.pdf
• http://www.scielo.org.ar/pdf/ram/v40n2/v40n2a13.pdf
• https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/CP001907.
• http://www.diversidadmicrobiana.com/index.php? option=com_content&view=article&id=80&Itemid=