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Nombre de la practica OBSERVACIÓN DE CÉLULAS PROCARIOTAS Objetivos General Observar la morfología bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de agrupaciones según la coloración. Específicos Reconocer, en las células procariotas, los dos grandes grupos en que estas se clasifican de acuerdo con su afinidad frente a la coloración de Gram. Identificar, en las células procariotas estructuras celulares facultativas: cápsula, inclusiones citoplasmáticas y endoesporas. Introducción El desarrollo de la teoría celular establece que la célula es la unidad estructural y funcional de los seres vivos y la necesidad biológica de su génesis a partir de células preexistentes. Se ha considerado, que las primeras células estuvieron formadas por membrana celular citoplasma y material hereditario (ADN). Este último está suspendido en el citoplasma y carece de membrana; este tipo de organización celular se denomina procariota. A través de la evolución en estas celular se generaron cambios que crearon células con estructuras internas especializadas, sistema de membrana y un núcleo donde almacena el ADN, a este tipo de organización se les denomina eucariota. (Cooper y Hausman, 2006) Las procariotas comprenden dos de los dominios evolutivos: Bacteria y Archaea, diferenciados por su historia evolutiva. Sus diferentes especies comparten una estructura celular de tipo procariota. La célula procariota es una entidad independiente caracterizada por ser de menor tamaño de las eucariotas, presenta tamaños desde 0,1-0,2 micras de ancho y hasta 50 micras de diámetro.
Bacterias
Se llama bacterias a un dominio de microorganismos procariotas (desprovistos de núcleo celular) de diversas formas y tamaños posibles, que junto a las arqueas, constituyen los seres vivientes más primitivos y más abundantes del planeta Tierra, adaptados a prácticamente todas las condiciones y hábitats, incluido el parasitario. Algunas pueden incluso subsistir en condiciones hostiles, como el espacio exterior. Las bacterias son descendientes inmediatos de las primeras formas de vida unicelular del planeta, surgidas en condiciones muy distintas a las actuales hace unos 4.000 millones de años. Se ignora si dichos seres fueron más semejantes a las arqueas o a las bacterias, pero se sabe que son su antepasado común. Sin embargo, las bacterias han estado implicadas, quizá debido a su abundancia, en la mayoría de los saltos evolutivos celulares, como es el origen de las mitocondrias (en las células eucariotas) o los cloroplastos (en las células vegetales), mediante procesos de endosimbiosis. Asimismo, estos seres vivientes tienen relaciones con prácticamente todas las formas de vida del planeta, ya sea de comensalismo (ej.: bacterias que proliferan sobre la piel), mutualismo (ej. las que colaboran con la descomposición de la comida en el intestino) o de parasitismo (causantes de infecciones y enfermedades). Para combatir estas últimas, el ser humano creó los antibióticos. Por otro lado, la vida bacteriana es indispensable en los procesos de descomposición de la materia orgánica, necesarios para el reciclaje de elementos como el carbono o el nitrógeno, y constituyen el piso de las cadenas tróficas microscópicas en diversos ambientes. Las bacterias se reproducen con velocidad y mediante procedimientos asexuales, que consisten en la replicación de la célula progenitora en dos exactamente iguales a ella (mitosis o fisión binaria). Se estima que, en un ambiente propicio, una bacteria se divida en dos en apenas 15-20 o 20-30 minutos, dependiendo de la especie.[ CITATION Mar1 \l 9226 ] Tipos de bacterias Bacterias según su forma: o Bacilos. Formas alargadas, como barras microscópicas. o Cocos. Con forma esférica o redonda.
La estructura unicelular bacteriana puede ser bastante simple, sin núcleo celular y casi sin orgánulos definidos, pero con un nucleoide (región irregular donde se halla el ADN circular de los procariotas), una pared celular de peptidoglicano que recubre la célula por fuera de la membrana plasmática y frecuentemente pili o flagelos para desplazarse. i membrana celular
Dispersos en el citoplasma bacteriano suele haber plásmidos (pequeñas moléculas de ADN no cromosómico), vacuolas (depósitos de sustancias de reserva) y ribosomas (síntesis de proteínas). Algunas bacterias presentan compartimientos procariotas, primitivos orgánulos rodeados por membranas, destinadas a labores bioquímicas puntuales dentro de la célula, dependiendo de su metabolismo. También encontramos apéndices (proyecciones de la superficie celular) que les permiten adherirse a las superficies, moverse o transferir ADN entre ellas. Los filamentos delgados llamados fimbrias (singular fimbria ), como los que se muestran en la imagen 1, se usan para la adhesión: ayudan a las células a pegarse a los objetos y superficies de su entorno. Los apéndices más largos, llamados pili (singular: pilus ), son de diferentes tipos y tienen diversas funciones. Por ejemplo, los pili sexuales mantienen unidas a dos bacterias y permiten la transferencia de ADN entre ellas en un proceso conocido como conjugación. Otros tipos de pili bacterianos, denominados pili tipo IV , ayudan a que la bacteria se mueva en su medio ambiente. Sin embargo, los apéndices más comunes para la locomoción son los flagelos (singular: flagelo ). Estas estructuras parecidas a una cola se mueven como hélices para impulsar a las células a través de ambientes acuosos.[ CITATION Lae \l 9226 ] Ejemplos de bacterias más comunes: Escherichia coli. Una bacteria gram negativa frecuente en los tractos gastrointestinales del ser humano y otros animales de sangre caliente, capaz en determinados momentos de suscitar ii imagen 1: fimbrias
fulminante. [ CITATION 10b13 \l 9226 ] Clostridium Tetani. La bacteria responsable del tétanos. El tétanos es producido por una neurotoxina que segrega esta bacteria. La infección por parte de esta bacteria ocurre cuando esporas de este Clostridium penetran en el organismo a través de heridas infectadas. Salmonella. Existe la salmonella entérica y la salmonella tifoidea. Se propaga a través de las heces y la orina. Hay personas que son totalmente asintomáticas (persona porta la enfermedad o infección pero no experimenta síntomas). Yersinia pestis. Es la responsable de la peste bubónica que ha sido directamente responsable de más muertes humanas que cualquier otra enfermedad infecciosa, con excepción de la malaria. Se transmite por la picada de pulgas.[ CITATION 10b13 \l 9226 ] Vibrio cholerae. La bacteria que produce cólera. Es una enfermedad del intestino que causa diarreas y vómitos. Las víctimas mueren de deshidratación. Aproximadamente el 75% de las personas infectadas no presenta ningún síntoma, a pesar de que el bacilo está presente en sus heces fecales durante 7 a 14 días después de la infección y vuelven al medio ambiente, donde pueden infectar a otras personas. [ CITATION 10b13 \l 9226 ] Acinetobacter baumannii. Es resistente a la mayoría de los antibióticos. Algunas estimaciones afirman que la enfermedad podría estar matando a decenas de miles de pacientes en Estados Unidos cada año. Puede causar neumonía severa e infecciones del tracto urinario. Las unidades más afectadas son las de cuidados intensivos y quemados, donde el uso masivo de antibióticos puede seleccionar la aparición de cepas multirresistentes. [ CITATION 10b13 \l 9226 ] Tinción Gram (antecedentes) Hace casi 90 años, el doctor Hans Christian Joachim Gram describió un método de tinción que le permitía distinguir a las bacterias en cortes de tejidos de mamíferos. Con otros métodos de tinción, las bacterias resultaban difíciles de visualizar, ya que
se teñían del mismo color de las células, los fragmentos histológicos y la fibrina. Los cortes histológicos tratados con el colorante de Gram, anilina-violeta de genciana, seguido de yodo-yoduro de potasio y decolorados a continuación con alcohol para eliminar el colorante de las células, de los fragmentos histológicos y de la fibrina, sin decolorar las células, bacterianas, representaba en conjunto un gran avance. Posteriormente, se demostró que con el método de tinción de Gram ciertas bacterias mantenían el color azul (grampositivas) mientras que otras eran decoloradas por el tratamiento con alcohol (gramnegativas). Se sabe que existen diferencias estructurales fundamentales entre las bacterias grampositivas y gramnegativos, aunque los mecanismos exactos de tinción y decoloración no sean aun totalmente conocidos. Con el tiempo, la técnica de tinción de Gram ha sido modificada numerosísimas veces, aunque todos los métodos empleados hoy día se siguen denominando tinción de Gram. La calidad y pureza de los colorantes ha mejorado considerablemente, y en la actualidad se emplea como colorante primario el cristal violeta (compuesto químico específico), como contra tinción final se utiliza usualmente la safranina. Las bacterias Gram positivas pierden esta característica en un medio acido, que es el que predomina en muchas muestras clínicas. El mordiente de yoduro es también relativamente inestable especialmente si se encuentra en contacto con la luz y el calor. La eliminación del complejo cristal violeta-yoduro que se halla laxamente unido a las bacterias y que recibe el nombre de decoloración puede llevarse a cabo mediante lavado con etanol, una mezcla de etanol y acetona o con acetona. La acetona por si misma actúa con rapidez excesiva, lo que hace que incluso las bacterias Gram positivas pueden perder la tinción. El etanol actúa mucho más lentamente y puede no llegar a decolorar totalmente a las bacterias gramnegativos. En consecuencia se emplea generalmente una mezcla de etanol y acetona.
Archaea
La posterior clasificación y estudio de los elementos del dominio arquea de forma independiente se adjudica principalmente a Carl Woese, quien en los años 70 comenzó a desarrollar arboles filogenéticos que permitían las disección elemental de los microorganismos, permitiendo caracterizar diferencias entre los propios organismos procariotas que ese momento incluían tanto las bacterias como las arqueas. Características de las Archeas [ CITATION Ped \l 9226 ]
Tienen una membrana unicelular cuya envoltura o pared es distinta a la de las bacterias; las membranas arqueas están
compuestas por lípidos con una composición glicerina distinta a la de los eucariotas, con la finalidad de brindar a las primeras una alta capacidad de resistencia térmica.
Las arqueas individuales tienen un diámetro variable (de 0.1 a 15 micrómetros) y pueden presentar múltiples formas, como
esféricas, espirales, y hasta rectangulares.
Sus flagelos presentan composiciones diferentes a los de las bacterias, pudiendo ser mucho más largos y gruesos.
El funcionamiento y las relaciones internas de las arqueas, aunque propias, son más similares al funcionamiento eucariota
que al bacteriano, en cuanto a sus procesos proteínicos.
La mayoría de las arqueas son consideradas extremofilas; capaces de vivir a más de 100°C, en geiseres o sumideros
submarinos, así como en condiciones extremadamente frías. Clasificación del dominio Archaea [ CITATION Ped \l 9226 ] Las arqueas se clasifican según su condición filogenética, que consiste en la relación de parentesco entre las especies. El dominio arquea parte de 16 secuencia genéticas de ARN (Ácido Ribonucleico), divididas en cuatro filos fundamentales: euriarqueotas, crenarqueotas, korarqueotas y nanoarqueotas. Euriarqueotas: Es uno de los filos principales del dominio archaea que contiene procariotas simples y abarca un amplio número de microorganismos. Estos presentan alta diversidad en su fisiología, morfología y hábitat natural. Antes, las euriarqueotas se encontraban en un mismo filo junto con las crenarqueotas; basándose en las secuencias de ARN, fueron separadas.
Crenarqueotas: También conocidas como crenotas, es el otro de los filos principales del dominio archaea. Son arqueas termófilas hipertermofilas, es decir que pueden soportar condiciones extremas de temperatura. Korarqueotas: Representan el tercer filo descubierto históricamente. Presenta cualidades hidrotérmicas y su presencia no se considera abundante en el planeta. Los cuerpos acuáticos de altas temperaturas representan su hábitat, y dependiendo de condiciones geográficas, acuáticas (salinidad, pH) y de temperatura. Nanoarqueotas: Es un filo que solo incluye a la especie Nanoarchaeum equitans , la cual fue descubierta en el año 2002. Se ha determinado que, al igual que las korarqueotas, se encuentra distribuida en ambientes hidrotermales y de altas temperaturas. Al contrario que las especies pertenecientes a los demás filos, se ha inferido que la especie nanoarqueota necesita de un huésped arquea para poder sobrevivir (Es considerado un simbionte). La naturaleza extremofílica de las arqueas ha estimulado los esfuerzos por profundizar y entender las capacidades de adaptación fisiológica que han desarrollado estos microorganismos para sobrevivir en condiciones extremas, y de esta forma intentar desarrollar componentes biotecnológicos que puedan explotar estos principios. Han sido las enzimas los elementos claves para poner a prueba estas determinaciones, sin embargo, las dificultades que presenta el aislamiento de estas han prevenido que se puedan desarrollar proyectos a gran escala. Las paredes celulares de algunas células del domino archaea contienen un polisacárido similar al peptidoglicano, este es el pseudopeptidoglicano; mientras que las gran mayoría carece de este y están formados por polisacáridos, glicoproteínas o proteínas. (Starr y Taggar, 2004)
mezclar, inclinando el portaobjetos o soplando sobre él. Dejar teñir durante 30-60 segundos.
4. Inclinar el portaobjetos para decantar el colorante y cubrir el cristal violeta con yoduro. Dejar en reposo durante 30- segundos. 5. La decoloración constituye el paso más crítico de la técnica. Inclinar el portaobjeto para decantar la solución de yoduro, y lavarlo con acetona- alcohol, manteniéndolo en un ángulo de más de 15 grados, hasta que la solución deje colorearse de azul. No hay que intentar decolorar las zonas más gruesas de la extensión, ya que de esta forma se decoloran excesivamente las zonas menos gruesas, que son precisamente las que podrán ser estudiadas en el microscopio. 6. Lavar inmediatamente el portaobjetos con agua fría corriente para eliminar el alcohol-acetona, y detener así la decoloración. 7. Cubrir el portaobjetos con safranina (es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la Tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram+ y tiñe de rosa a las bacterias G- ; en histología y en citología); dejar 15-30 segundos y lavar con agua corriente. 8. Secar con un paño la parte inferior del portaobjetos para eliminar los restos del colorante; dejar secar al aire.
Bacteria Gram positiva
Tiene una capa gruesa de Peptidoglicano (mureina) el cual representa el 90% de la pared celular, y tiene dos clases de ácidos: Ácido lipoteicoico, se encuentra en la superficie en la capa de Peptidoglicano y unido a la membrana citoplasmática; y el Ácido teicoico de
la pared que está en la superficie y se une solo a la capa de Peptidoglicano. Entre la membrana citoplasmática y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte. [ CITATION Hec10 \l 9226 ] Los ácidos teicoicos son moléculas de polisacáridos, los cuales debido a su carga negativa, son los responsables de la carga negativa ne ta de la superficie de las células, y pueden intervenir en el paso de iones a través de la pared celular. (Davis y Dulbecco, 1979)
Bacteria Gram negativa
Tiene una capa delgada de Peptidoglicanos unida a una membrana exterior por lopoproteinas. La membrana exterior etas hecha de proteína, fosfolípidos y lipopolisacárido. En el lipopolisacárido, la porción de lípido está unida en el fosfolípido y el antígeno O- polisacárido está en la superficie. El lípido se llama lípido A y es toxico, pero el lipopolisacárido entero se llama endotoxina. La pared celular tiene poros llamados porines que ayudan en el transporte de substancias de peso molecular bajo. Entre la membrana citoplasmática y la pared celular hay un espacio periplásmico con enzimas hidrolíticas, enzimas inactivadoras de antibióticos y proteínas de transporte.[ CITATION Hec10 \l 9226 ] Clasificación según tinción de la pared celular Tinción de Gram Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona (decoloración) Safranina Tinción Gram positivos Tinción Gram negativos
bacterianas es complejo por su situación, en el interior del cuerpo celular , y por su estructura, con varias cubiertas impermeables. Por ello se requieren tinciones con calor para favorecer la penetración de los colorantes. La técnica más empleada es la tinción de Wirtz-Conklin , que se practica sobre extensiones fijadas por calor. Los únicos géneros que producen esporas son Bacillus y Clostridium Fundamento Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos, etc.) formándose una espora por cada forma vegetativa. Al finalizar el proceso de esporogénesis, la célula vegetativa se lisa y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora germina generando una nueva forma vegetativa. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son patógenas para el hombre, por lo que su estudio y observación son de enorme interés. Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos. Además, estas cubiertas hacen que las esporas aparezcan en el microscopio óptico como estructuras refringentes y de difícil tinción. La tinción específica de esporas requiere dos colorantes: 1.- Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente. 2.- Safranina: colorante de contraste que tiñe las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tinción, no perderán el colorante en el lavado con agua, y sí lo harán las formas vegetativas, que quedarán teñidas con el segundo colorante. Pruebas bioquímicas Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano.
Hidrólisis del Almidón Agar Almidón Sustrato: Almidón (polímero de glucosa). Enzima: Amilasa (exoenzima). Producto: Glucosa. Revelador: Lugol. El lugol con el almidón forman un complejo color café-púrpura que desaparece cuando el almidón ha sido degradado. El almidón es producido principalmente por plantas superiores, está compuesto de amilosa y amilopectina. Diversas enzimas amilolíticas hidrolizan almidón y sus Prueba negativa Prueba positiva productos. Degradación de la caseína Agar Leche Descremada Sustrato: Caseína (proteína). Enzima: Caseinasa (Proteasa, exoenzima). Producto: Aminoácidos. Revelador: No requiere. Las proteasas son excretadas al medio para la degradación de proteínas, la caseína es la proteína de la leche que le confiere el color blanco, cuando la caseína es hidrolizada desaparece el color blanco alrededor del crecimiento microbiano. Hidrólisis de la lecitina y reducción del telurito Agar yema de huevo/Agar Baird Parker Sustrato: Lecitina. Enzima: Lecitinasa. Producto: Fosforilcolina. Revelador: No requiere.
Indicador: Azul de bromotimol u otro indicador ácido/base. Las bacterias utilizan hidratos de carbono por uno de dos procesos metabólicos, fermentativo u oxidativo. La principal diferencia es la necesidad de oxígeno atmosférico y una fosforilación inicial. Por prueba se inoculan dos tubos de medio y uno de ellos se sella con aceite mineral o parafina para impedir la entrada de oxígeno. La fermentación requiere de una fosforilación inicial, utiliza las vías de la Glucólisis (Embden-Meyerhof-Parnas EMP), de las Pentosas fosfato y Entner- Doudoroff. Hugh and Leifson. Utilización de citrato positiva Medio de Citrato de Simmons Sustrato: Citrato de sodio. Vía: Varias dependientes del pH del medio. Producto: Acetato/formato en condiciones alcalinas y Acetato, CO 2, lactato/Acetoína y CO 2 en condiciones ácidas. Indicador: Azul de bromotimol. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como única fuente de carbono también utiliza las sales de amonio del medio como única fuente de nitrógeno. La extracción de nitrógeno de las sales de amonio producen amoniaco y se alcaliniza el medio virando el indicador al alcalino Agar Hierro de Kligler (KIA) Agar hierro de Kligler Sustratos: Glucosa 0.1%, lactosa 1% y Tiosulfato o grupos –SH de la cisteína. Vía: Fermentativa y Enzimas: Tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa Productos: Ácidos mixtos y H 2S. Indicadores: Rojo de fenol y sales de Fe2+. En presencia de tiosulfato en el medio o la degradación de proteínas liberando aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H 2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteína desulfurilasa. El gas
incoloro H 2S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico. Ureasa Caldo urea o agar urea de Cristensen. Sustrato: Urea. Enzima: Ureasa. Producto: Amoníaco. Indicador: Rojo de fenol. La hidrólisis de la urea por la enzima ureasa libera dos moléculas de amoniaco que alcaliniza el medio, entonces se vira el indicador de pH, en el caso del rojo de fenol una prueba positiva es color bugambilia. Descarboxilasas Medio base de descarboxilasas u otros medios como LIA o MIO. Sustrato: Aminoácidos (lisina, ornitina o arginina). Enzimas: Descarboxilasas. Producto: Amoníaco. Indicador: Púrpura de bromocresol. Los aminóacidos al perder el grupo carboxilo se convierten en diaminas lo que incrementa el pH del medio y el indicador (púrpura del bromocresol) vira a violeta. Las descarboxilasas son útiles en la diferenciación de enterobacterias. BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificación de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plástico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultáneamente en una etapa y permiten la detección de 15 características bioquímicas.
