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v150806 Fisiología Vegetal (F.A. Squeo & L. Cardemil, eds.)JORDÁN & CASARETTO Ediciones Universidad de La Serena, La Serena, Chile (2006) 15: xx-xx
Capítulo XV
Hormonas y Reguladores del Crecimiento:
Auxinas, Giberelinas y Citocininas
Miguel Jordán^1 y José Casaretto^2
CONCEPTO DE HORMONA
Las hormonas en plantas, vinculadas con todas las respuestas morfogénicas durante la on- togenia de las plantas, son relativamente escasas en número. Un análisis conjunto de todas ellas, desde su descubrimiento en la década de 1930, se resumen los siguientes conceptos:
- A pesar de su escaso número (menor a diez), se encuentran sin embargo en todas las plantas terrestres y acuáticas de aguas dulces, de diferentes formas, hábitats, ciclos y formas de vida, ya sea en plantas geófitas, arbustivas como igualmente en árboles de gran altura y en todas las especies distribuidas en las más diferentes familias botáni- cas.
- Aún, a pesar del relativo escaso número de ellas y, al contrario que en organismos animales, su interacción permite regular todas las respuestas de crecimiento y desa- rrollo durante la ontogenia de las plantas.
- Se trata de compuestos de estructura química relativamente simple; que no cuentan con grupos proteicos asociados. Uno de ellos, el etileno, es además de naturaleza ga- seosa.
- No se caracterizan por generar un efecto específico; es decir, su acción puede derivar en varios efectos diferentes a corto y/o a largo plazo.
- A diferencia de la generalidad de hormonas animales, algunas pueden tener acción en los mismos sitios de su síntesis.
- En algunos casos, la presencia y acción conjunta de dos fitohormonas (por ejemplo auxinas y citocininas) puede inducir y fijar un tipo determinado de expresión morfo- génica de acuerdo a los niveles relativos entre sí, o de cada una de ellas, en un tejido. Así por ejemplo, auxinas y citocininas, de acuerdo a su nivel relativo pueden conducir a la formación de brotes, alternativamente de raíces y/o a la proliferación de masas celulares sin mayor organización.
- Algunas parecen tener sitios o receptores comunes a nivel de membrana.
- Existen compuestos denominados “reguladores de crecimiento”, que pueden ser de
(^1) Departamento de Ecología, Facultad de Ciencias Biológicas, P. Universidad Católica de Chile. Av.
Libertador Bernardo O’Higgins 340, Santiago, Chile. E-mail: mjordan@bio.puc.cl (^2) Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología, Universidad de Talca. E-mail: jcasaretto@utalca.cl
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naturaleza química diferente a algunas hormonas y/o “desconocidas o nunca codifica- das” por el metabolismo celular, que pueden igualmente desarrollar efectos semejan- tes a hormonas endógenas naturales. Algunas de ellas provocan respuestas más in- tensas que los compuestos naturales a igual concentración molar. Al mismo tiempo algunas de estas substancias sintéticas de acción afín también pueden ser reconoci- dos por receptores específicos de hormonas naturales (por ejemplo: auxina y regula- dores no naturales del “tipo auxina”).
En estos dos capítulos se describen las fitohormonas más importantes: auxinas, gibereli- nas, citocininas, etileno y ácido abscísico y otras cuya importancia en distintos procesos de crecimiento y desarrollo ha sido dilucidada más recientemente: brasinoesteroides, ácido jasmónico, ácido salicílico y poliaminas. Otros compuestos como la turgorinas, sistemina, fitosulfoquinas cuya acción es limitada a uno o muy pocos procesos fisiológicos o bien sólo actúan en muy pocas especies, generalmente no son por hoy todavía consideradas como reguladores de crecimiento y no serán analizadas.
Crecimiento y Desarrollo
Es sorprendente que un número tan bajo de hormonas en las plantas de cuenta de la mor- fogénesis particular que se expresa en tantos tipos de plantas con la más diversa morfolo- gía. Consideremos por ejemplo que en primates, animales que poseen una mayor semejan- za entre sí, sin embargo su pool hormonal es mucho más amplio.
La presencia de hormonas en diferentes niveles en las plantas y sus células, permite que éstas desarrollen caminos morfogénicos alternativos muy distintos, los cuales pueden darse todos de acuerdo al grado de ontogenia. Lo más general es que las células en crecimiento por acción de varias hormonas expresen división y elongación celular; sin embargo, y espe- cialmente bajo condiciones in vitro , se ha observado que tales células inician procesos de diferenciación bajo ciertos niveles hormonales, por ejemplo, generación de elementos xile- máticos. A nivel tisular en cambio las respuestas pueden ser más sorprendentes. Si se combinan diferentes niveles de auxinas y citocininas pueden darse varias respuestas alter- nativas: la presencia de niveles relativamente altos de ambas hormonas conduce solo a una multiplicación celular con escasa diferenciación. Si existiese un nivel relativamente alto de citocininas vs. auxinas, el tejido manifiesta la formación de nuevos brotes a cambio de la intensa proliferación celular vista antes. Si por el contrario, los niveles de ambas hormo- nas se invierten de manera de tener una relación más alta de auxinas vs. citocininas, la ex- presión del tejido cambia y se originan raíces. De manera que, las células vegetales que cuentan con núcleo y tienen un grado de diferenciación relativo, pueden bajo ciertas condi- ciones revertir a su estado meristemático y expresar luego diferentes respuestas conducen- tes todas a la generación de órganos y plantas. Se trata de células totipotentes. Esta pro- piedad se ha usado en ciencia y tecnología permitiendo regenerar plantas fértiles en forma masiva in vitro a partir de células y a la vez, lograr los avances en ingeniería genética. Con ello se han generando plantas modificadas a partir de células que han recibido y codificado positivamente nuevos genes insertos que se expresan en plantas viables y son reproduci- bles genéticamente y fielmente en el tiempo, mediante el potencial de la biotecnología deri- vada de la totipotencia celular vegetal.
AUXINAS
Uno de los ensayos más antiguos sobre crecimiento vegetal implicó estudios sobre la biolo- gía y mecanismos de acción de las auxinas, las primeras hormonas vegetales en ser descu- biertas. El primer indicio de su existencia se derivó de experimentos realizados por Darwin
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dos de IAA y niveles casi no detectables de glucosinolatos indólicos, lo que ratifica al IAOx como intermediario común (Fig. 1). Varios glucosinolatos son de mucho interés, no sólo por constituir una fuente de auxinas conjugadas, sino también por las características de su sa- bor y propiedades medicinales antioncogénicas. El intermediario común entre los glucosino- latos indólicos y IAA es el indol-3-acetonitrilo, el cual es convertido a IAA por enzimas nitri- lasas (Normanly et al. 1997).
Hace pocos años, sin embargo, investigadores que buscaban genes que regulan enlonga- ción de hipocotilos en la oscuridad, hallaron un gen que codifica a una enzima de tipo flavín monooxigenasa (FMO) que resultó ser clave para la síntesis de auxina (Zhao et al. 2002). La planta mutante obtenida tenía hipocotilos largos y dominancia apical pronunciada y hojas que se curvaban hacia abajo, crecimiento característico de una sobreproducción de auxinas. El análisis de estas plantas reveló que, en efecto, éstas presentaban niveles cre- cientes de auxina. El gen activado en la mutante, llamado YUCCA (por el fenotipo de la mu- tante similar a la planta de la yuca), pertenece a dos familias de genes del tipo FMO. Tal redundancia explicaría porqué intentos anteriores de varios investigadores para producir mutantes de auxina de tipo “knock-out” no habían sido exitosos. Estudios de esta enzima de tipo FMO revelaron que la enzima sería capaz de catalizar la oxigenación del compuesto intermediario triptamina, lo que ayudaría a aclarar una vía de síntesis de auxina a partir de Trp que ha sido muy discutida en años anteriores.
Además de estas rutas biosintéticas dependientes de Trp, se ha postulado que las plantas también serían capaces de sintetizar IAA a través de vías independientes de Trp. Plantas que no pueden sintetizar Trp han demostrado ser capaces de producir auxina (Ouyang et al. 2000). Las mutantes de Arabidopsis trpαβ y trpβ , por ejemplo, deficientes en la Trp sin- tasa α y β , respectivamente, son capaces de acumular compuestos conjugados de IAA, aún presentando niveles muy bajos de Trp. Por otro lado, la mutante trp1, que tiene niveles
Fig. 1. Estructura de algunas auxinas naturales (IAA, IBA, PAA, Cl-IAA) y sintéticas (NAA, dicamba, 2,4-D y 2,4,5-T).
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muy bajos de la enzima indol-3-glicerol fosfato sintasa (IGS) no acumula IAA conjugados, lo que explica que una ruta alternativa independiente de Trp a partir de indol-3-glicerol fos- fato podría ser importante en plantas aunque su influencia en el producción total de auxina aún se desconoce (Fig. 1; Tabla 1).
La distinta localización de las enzimas involucradas en la síntesis de auxinas provee mayor información respecto a cómo se controlan los niveles de compuestos indólicos en la célula. Por ejemplo, CYP79B2 ha sido localizada en cloroplastos, mientras algunas enzimas para la síntesis de glucosinolatos indólicos se localizan preferentemente en el retículo endoplásmico y YUCCA en el citosol. Estas observaciones sugieren que existiría una gran cantidad de trá- fico de intermediarios indólicos que controlarían las rutas metabólicas descritas. La res- puesta de un tejido determinado de la planta a auxina depende de la concentración de la hormona y sensibilidad a ella. El nivel endógeno de auxina en la planta puede regularse no sólo por su tasa de síntesis y velocidad de transporte entre órganos, sino también por me- canismos de desactivación. La desactivación de IAA puede ocurrir mediante su conjugación con otras moléculas como azúcares o aminoácidos. La idea de la presencia de formas con- jugadas de auxinas se originó de los trabajos pioneros que involucraban tres formas distin- tas para extraer IAA, una difusión simple, otra algo más difícil que requería el uso de sol- ventes orgánicos y, por último, una tercera forma que requería métodos más enérgicos, como hidrólisis con NaOH o el empleo de enzimas proteolíticas (Thimann 1977). Las formas conjugadas son generalmente inactivas, aunque algunas formas conjugadas de IAA han demostrado ser activas en bioensayos. La existencia de formas conjugadas cumple las fun- ciones de almacenamiento, transporte, protección y desintoxicación por exceso de IAA. Así, el nivel intracelular de auxina activa depende de su síntesis, transporte, degradación y compartimentación.
IAA puede ser inactivado en casi todos los tejidos vegetales y diferentes especies tienen distintas clases de conjugados de IAA. La concentración de IAA libre en plantas varía de 1 a 100 mg/kg peso fresco, mientras que los niveles de auxina conjugada son en ocasiones sustancialmente más elevados. En Arabidopsis , por ejemplo, ensayos de lisis alcalina que libera IAA de sus formas conjugadas, indicaron que aproximadamente un 90% de IAA está
Gen Enzima Mutante ASA1 (trp5), ASA2 Antranilato sintasa trp ASB1 (trp4), ASB2, ASB3 Antranilato sintasa trp PAT1 (trp1) Fosforibisil antranilato transferasa trp PAI1, PAI2, PAI3 Fosforibisil antranilato isomerasa IGS1 Indol glycerol fosfato sintasa TSA1 (trp3) Triptófano sintasa a trp TSB1 (trp2), TSB2 Triptófano sintasa b trp YUCCA Tipo flavin monooxigenasa Yucca AAO Indol-3-acetaldehído oxidasa CYP79B2, CYP79B3 P450 monooxigenasas cyp79b2, cyp79b AMI1 Indolacetamida hidrolasa NIT1, NIT2, NIT3 Nitrilasa nit
Tabla 1. Genes implicados en la biosíntesis de IAA en Arabidopsis descritos en la Figura 1. (Revisados en Woodward y Bartel, 2005)
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dos débiles que se encuentran generalmente protonadas en el pH relativamente bajo del apoplasto, de acuerdo al modelo quimiosmótico, un gradiente de pH entre la pared celular (pH ~5) y el citoplasma (pH ~7) facilitaría la entrada de la forma reducida de IAA a través de la membrana citoplasmática (Lomax et al. 1995). Una vez al interior de la célula, el alto pH del citoplasma resulta en la ionización del IAA, impidiéndose la salida de éste en forma oxidada. El importe de IAA se puede incrementar en algunos tejidos con la ayuda de algu- nos transportadores (Swarup et al. 2004). Se ha observado que uno de los primeros mu- tantes del transporte de auxinas en Arabidopsis fue aux1 , el cual codifica a una proteína de transmembrana similar a las permeasas de amino ácidos. AUX1 y otras proteínas similares, están localizadas asimétricamente en membranas plasmáticas facilitando el transporte uni- direccional de auxina (Swarup et al. 2004). La salida de auxina de la célula es en definitiva un proceso activo y dependiente de varios factores como las proteínas PIN y miembros de la familia de proteínas de resistencia a múltiples drogas (MDRs). Parece ser que las proteí- nas PIN no son capaces de transportar auxina en forma directa, sino más bien cooperan con las proteínas MDRs para la exportación de IAA (Paponov et al. 2005). Las proteínas PIN tienen varios motivos de transmembrana y se reciclan entre la membrana plasmática y compartimentos de vesículas intracelulares (Geldner et al. 2001). Al igual que AUX1, las proteínas PIN están asimétricamente distribuidas en la membrana plasmática. El movimien- to polar hacia las raíces por los tejidos asociados con vasos xilemáticos, está correlacionado con la localización superior de AUX1 y basal de proteínas PIN en estas células. El sistema de exportación de auxinas gobernado por proteínas PIN es suficiente para generar una dis- tribución diferencial de auxina en los tejidos, siendo los importadores de auxina necesarios sólo en tejidos donde se requiera una repartición rápida de la hormona. La localización po- lar de las proteínas PIN es compleja y dinámica; se re-localizan dependiendo de la necesi- dad de auxina por el tejido. La distribución de auxina en la raíz también está dirigida por proteínas PIN las cuales se pueden mover del centro de máxima concentración de auxinas cerca al meristemo radicular hacia la zona de elongación (Friml et al. 2003). La redistribu- ción de IAA es requerida para regular la elongación de células conforme éstas se distancian del meristema y ubican en la zona de elongación. Recientemente se ha descrito que la auxina re-localizada en la zona de elongación también puede ser reciclada al transporte po- lar hacia el centro de la raíz, regresando al ápice radicular (Blilou et al. 2005). La transcrip- ción, acumulación y localización subcelular de proteínas PIN también son reguladas por auxina, lo que sugiere que esta hormona regula su propia distribución. Por eso, mutaciones de algún miembro de genes PIN tiene poco efecto sobre la distribución de auxina, pues la hormona sería capaz de cambiar la expresión de otros genes PIN para compensar la pérdi- da de uno de ellos (Blilou et al. 2005).
Mediciones del transporte de auxinas en diferentes tipos de tejidos sugieren que la veloci- dad de transporte es independiente de la longitud del tejido y de la concentración de auxi- na en el tejido o fuente donadora de la hormona, lo que a su vez indica que no se trata simplemente de un proceso de difusión. Sin embargo, la rapidez del transporte varía con la edad y tipo de tejido, siendo en maíz, por ejemplo, mayor en coleoptilos que en raíces.
Efectos fisiológicos de las auxinas
Crecimiento y formación de raíces****. Debido a que las auxinas influencian tanto la divi- sión, como el crecimiento y diferenciación celular, están involucradas en muchos procesos del desarrollo, en algunos de ellos interactuando con otras fitohormonas. Diversos bioensa- yos han sido descritos para analizar respuestas a auxinas, los cuales han sido útiles en la identificación de compuestos con actividad típica de auxinas y de plantas mutantes con de- fectos en la síntesis, metabolismo o respuestas a auxinas. Uno de los ensayos que caracte- rizan el efecto de auxinas en el desarrollo es la regulación del crecimiento radicular el cual es definido desde el desarrollo embrionario (Jenik & Barton 2005). Mientras las auxinas es- timulan el crecimiento de los tallos y coleoptilos, inhiben el crecimiento de la raíz primaria, pero estimulan la formación de raíces secundarias. La concentración óptima para el promo-
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ver elongación de tallos es entre 10-6^ y 10-5^ M, sin embargo, en raíces esta concentración es muy alta y retarda su crecimiento. Las auxinas además promueven la biosíntesis de la hormona etileno que inhibe el crecimiento radicular. Niveles menores a 10-9^ M de IAA serí- an capaces de inducir crecimiento de raíz, pero no ocurriría a niveles normales endógeno más altos.
El proceso de rizogénesis está íntimamente asociado a la división celular. Una práctica co- mún en horticultura es aplicar auxinas para favorecer el enraizamiento de esquejes. En téc- nicas de cultivo de tejidos se utilizan auxinas y citocininas para promover la división celular y la diferenciación de raíces y tallos, respectivamente. Las auxinas estimulan a la división de células localizadas en el periciclo en la zona justo arriba de la zona de elongación para provocar la formación de raíces laterales. Este fenómeno también se aplica en la formación de raíces adventicias la cual puede ocurrir en varios tejidos donde existan un grupo de cé- lulas en activa división.
Regulación de tropismos. Mientras el crecimiento puede ser definido como un proceso irreversible derivado de la elongación celular, los tropismos son movimientos de crecimien- to direccionales en respuesta a un estímulo también direccional. El efecto que tienen las auxinas sobre el crecimiento de tallos y raíces es importante para controlar los tropismos. Estas respuestas se concretan con curvaturas, giros o inclinaciones que realizan los tallos y raíces hacia un estímulo de luz (fototropismo), de gravedad (geotropismo o gravitropismo), o de contacto (tigmotropismo). Estos crecimientos direccionales se explican con el modelo clásico de Cholodny-Went, el cual describe que una distribución lateral diferencial de auxina en el tallo o raíz es responsable del crecimiento diferencial del órgano. En el caso del foto- tropismo, la auxina que se produce en el ápice, en vez de ser transportada hacia la base, es transportada lateralmente hacia el lado sombreado. Asimismo, se han encontrado varias proteínas que actuarían como receptoras para el fototropismo (fototropinas). Una de ellas, NPH1, es fosforilada en un gradiente lateral durante la exposición a luz azul lateral. De acuerdo con el modelo clásico, la fosforilación en gradiente de NPH1 induciría de alguna manera el movimiento de auxina hacia el lado no iluminado del tallo o coleoptilo. Sin em- bargo, la regulación de la respuesta fototrópica es más compleja, pues la actividad de ésta y otras fototropinas varía dependiendo la calidad de luz y la acción de fitocromos (Esmon et al. 2005). Una vez en el lado opuesto de la luz, la auxina es transportada en forma basipé- tala a la zona de elongación, donde aceleraría el crecimiento de esa zona con respecto a la zona iluminada, provocando la curvatura hacia la luz.
De forma similar, el mismo modelo se puede aplicar para explicar las respuestas de tallos y raíces a la gravedad. Durante la respuesta geotrópica, si una planta en crecimiento se colo- ca de lado, el tallo tiende a curvarse hacia arriba y las raíces hacia el suelo. Cuando la plan- ta está en posición horizontal, la fuerza de la gravedad hace que la auxina se distribuya mayormente en la parte inferior del tallo o raíz. Mientras en el tallo las auxinas estimulan el crecimiento de la parte inferior (ocasionando una curvatura hacia arriba), en raíces un ma- yor nivel de la hormona inhibe el alargamiento de las células, por lo tanto, las de la cara superior se alargan más y la raíz se curva hacia abajo. Esta re-distribución de auxina en la raíz podría deberse a la percepción de la gravedad por algunas células que se localizan en el casquete, caliptra o cofia (Hou et al. 2004). Estas células (estatocitos) contienen los lla- mados estatolitos correspondientes a amiloplastos que sedimentan en repuesta al vector gravitacional. Una ubicación basal de los estatolitos ocasionaría un transporte polar de auxina a lo largo del lado inferior desde la cofia hacia la zona de elongación de la raíz, don- de retardaría el crecimiento.
Dominancia apical. La distribución en gradiente de auxina desde el ápice primario hacia la base de la planta reprime el desarrollo de brotes axilares laterales a lo largo del tallo, manteniendo así lo que se denomina como dominancia apical (Thimann 1977).
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en retículo endoplásmico ABP1 podría estar involucrada en conjugación o transporte intra- celular de auxina. Sin embargo, analizando mutantes de respuesta a auxina, recientemente se logrado identificar una proteína, TIR1, como el receptor de auxina. TIR1 es una proteína del tipo “caja F”, que se une a reguladores transcripcionales AUX/IAA que reprimen genes que responden a auxina y los marca para ser ubiquitinados y luego degradados por el pro- teasoma 26S. La unión de auxina a TIR1 activaría su interacción con AUX/IAA incitando la degradación de estos represores (Dharmasiri et al. 2005a; Kepinski & Leyser 2005). En Arabidopsis existirían otras 4 proteínas “caja F” que cumplirían función similar a TIR1 y en- tre todas gobernarían las señales de auxinas (Dharmasiri et al. 2005b).
Expresión génica. Auxina rápidamente ocasiona la acumulación transitoria de tres fami- lias de genes: SAURs (por small auxin upregulated RNAs), genes tipo GH3 y Aux/IAA (Abel & Theologis, 1996). Aunque se desconoce la función exacta de muchos de estos genes, va- rios de ellos están involucrados en conjugación y degradación de auxina y en mermar la señal por la hormona. Por ejemplo, las proteínas AUX/IAA forman dímeros con los factores de transcripción ARF inhibiendo la unión a elementos de promotor que responden a auxina (AuxREs; Liscum & Reed 2002). Una vez degradados AUX/IAA, los factores ARFs pueden formar homodímeros e inducir la expresión de varios genes blanco y desatar distintas res- puestas fisiológicas comúnmente medidas como respuestas de crecimiento. La inducción de muchos de estos genes ocurre en cuestión de minutos, como es el caso de los genes SAUR (small auxin up-regulated RNAs), los que se localizan en la zona de mayor elongación de tallos durante respuestas trópicas (Li et al. 1991). La expresión de otros puede tardar horas, implicándolos en respuestas de largo plazo. Entre éstos que se expresan más tardía- mente están genes que codifican a enzimas tipo GST (glutatión S-tranferasa; estimulados también por exposición a metales y otras condiciones de estrés), así como genes que codi- fican para ACC sintasas, enzimas clave en la biosíntesis de etileno (ver Capítulo 16).
Auxinas sintéticas y sus usos comerciales
Tras el descubrimiento de la estructura del IAA, se han obtenido compuestos químicos esti- mulantes del crecimiento basados en auxinas naturales (Fig. 2). En un principio se analiza- ron otros compuestos con anillo indólico, como el ácido indol butírico (IBA) y derivados del naftaleno como el ácido naftalenacético (NAA) y el ácido naftoxi-2-acético (NOA), que tam- bién resultaron activos. IBA fue clasificado inicialmente como una auxina sintética, pero es un compuesto endógeno de la planta, más eficiente que IAA en promover formación de raí- ces laterales y es usado comercialmente con este propósito. Posteriormente, el análisis de algunos ácidos fenoxiacéticos con actividad auxínica, llevó al descubrimiento del 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D). A partir de éste se desarrollaron varios compuestos con activi- dad auxínica, como el ácido 2-metoxi, 3,6-dicloro benzoico (dicamba), el ácido 2,4 dicloro- fenoxibutírico (2,4-DB), el ácido 2-metil, 4-cloro fenoxiacético (MCPA) y el ácido 2,4,5- triclorofenoxiacético (2,4,5-T), todos con propiedades herbicidas cuando se emplean a con- centraciones elevadas. Una combinación de 2,4-D y 2,4,5-T constituyó el nefasto “agente naranja” utilizado como arma química en la guerra de Vietnam con la finalidad de deshojar el bosque tropical. Esta mezcla resultó tóxica por la presencia de dioxina, un producto se- cundario originado de la producción de 2,4,5-T. Hoy en día 2,4-D es una herbicida de uso común.
Las auxinas sintéticas, que se usan en forma de aerosol o de polvo, tienen varias aplicacio- nes en la agricultura. Entre sus usos están frenar el brote de yemas de tubérculos de pa- pas, destruir hierbas de hoja ancha (2.4-D, 2,4-DB, 2,4,5-T) y prevenir la caída prematura de frutos (NAA) y pétalos de flores. Estos compuestos también se usan para obtener frutos sin semillas (partenocárpicos) como tomates, higos y sandías, y para estimular el creci- miento de raíces en esquejes (IBA, NAA).
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Fig. 2. Vías de biosíntesis del IAA. Las enzimas aparecen con el nombre de la supuesta enzima que catalizaría la reacción o con el nombre del gen representativo identificado en Arabidopsis. Ver Tabla 1 para mayor información.
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intermediarios o GAs de formas inactivas a moléculas activas.
La degradación de GAs es causada por acción de varias oxidasas. El tipo 20-oxidasa con- vierte GA 19 en GA 20 y 3-oxidasas convierten GA 20 en GA 5. Una 2-oxidasa puede también funcionar en el catabolismo de GA 20 para inactivar GA 29 y GA 1 a GA 8. Cabe destacar que existen interacciones de síntesis y degradación de GAs con otras hormonas, como el AIA. Se ha determinado que la presencia de AIA estimula la síntesis de GA 1 provocando consi-
Fig.3. Vía de biosíntesis de terpenos. Se muestran las dos rutas para la síntesis del IPP: a partir de gliceraldehído-3-fosfato y piruvato (en cloroplastos) y la ruta del mevalonato (citosólica). Distintos precursores terpenoides dan origen a citocininas, giberelinas, brasinoesteroides y ácido abscísico.
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guiente crecimiento. Por otro lado, la auxina además puede inhibir la degradación de GA 1 a GA 8 (inactiva), de manera de poder mantener la acción de GA 1 estimulando respuestas de crecimiento (Thomas et al. 1999).
Antagonistas
Una buena parte del estudio de la síntesis y acción de las GAs sobre las plantas se desarro- lló mediante el uso un grupo de compuestos sintéticos conocidos desde los años 60 deno-
Fig. 4. Vía de biosíntesis de las principales giberelinas a partir de GGPP en tres etapas y diferentes sitios celulares. Se indican algunas enzimas que catalizan reacciones importantes como también algu- nos genes identificados en Arabidopsis. Las flechas rojas muestran el lugar de síntesis en la célula. Aquellas giberelinas con alta actividad biológica en plantas están enmarcados en color verde.
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cas modernas de detección han mostrado que plantas altas poseen GA 1 mientras que en enanas predomina GA 20 (Hedden & Kamiya 1997).
- GAs promueven el desarrollo súbito de inflorescencias y la floración en muchas plan- tas, particularmente en aquellas de día largo (PDL), aunque no en aquellas de día cor- to (DC), salvo algunas excepciones. En asociación con fitocromos, cumplen un papel en la inducción de la floración; en particular, aunque de manera no conocida, inician- do señales a genes meristemáticos del tipo AGAMOUS vinculados a la diferenciación de estructuras florales tales como pétalos, estambres, carpelos, etc. (Yu et al. 2004).
- Inducen la germinación en semillas en condiciones de dormancia (Peng & Harberd 2002).
- Están involucradas en la movilización de reservas en granos de cereales. En especial inducen la síntesis de α-amilasas y proteasas. Este proceso tiene gran utilidad en la manufactura de cerveza.
- Promueven el desarrollo de muchos frutos, inducen partenocarpia y tienen una aplica- ción especial en la producción de uvas “sin semilla” (Kato et al. 2000).
Mecanismos de acción
A nivel de la elongación en tallos: Estimulan fuertemente la división y elongación celular en la porción sub-apical de los tallos y también en el meristema intercalar. Los mecanismos de división y elongación de la pared no están aun bien aclarados a nivel celular, pero se asume que el efecto de “soltura” de la pared celular sería diferente a la ejercida por la auxi- na (o reguladores de este tipo), aunque sería un efecto complementario. Al respecto se ha reconocido un efecto específico causado por GAs y no auxina sobre la actividad de la enzi- ma xiloglucano endotransglicosilasa (XET) la cual hidroliza xiloglucanos permitiendo nuevos arreglos de la pared (Jan et al 2004). A nivel génico, estudios en Arabidopsis han reconoci- do también la existencia de algunos factores represores de transcripción que bloquean el crecimiento en altura (RGA, GAI, SLR1). En presencia de GAs, estos represores son degra- dados, restableciéndose el crecimiento en forma normal (Thomas & Sun 2004). Reciente- mente, a través del mapeo genético de la mutante gid1 de arroz que no responde a GAs, se ha identificado una proteína que actúa como receptor de GAs. GID1 codifica una proteí- na tipo lipasa capaz de unir GA en forma específica y con gran afinidad. Además GID1 pue- de interactuar con SLR1 cuando GA está presente. Análisis genéticos definieron que la de- gradación de SLR1 depende de GID1. Sobre-expresión de GID1 en plantas transgénicas de arroz produjo plantas más largas, similar a una respuesta de sobredosis de GAs (Ueguchi- Tanaka et al. 2005). En resumen, el estatus normal de la planta es ser alta. Los regulado- res negativos la hacen enana en ausencia de GAs pero la hormona bloquea al regulador ne- gativo; de manera que, la negación de un regulador negativo ocasiona el efecto, en este caso, expresar la altura. Una respuesta parecida ocurre a nivel de internudos en el meriste- ma intercalar de arroz donde GAs actúan como reguladoras del ciclo celular. En este siste- ma, las GAs incrementan la expresión de genes de proteinas quinasas específicas para cicli- nas (CDKs) esenciales para entrar en mitosis. En el caso de arroz, el cual crece sumergido en agua, las condiciones de anoxia incrementan el contenido de etileno, que, a su vez, re- duce el nivel endógeno de otra hormona, ácido abscisico (ABA). Al reducir el nivel de ABA, la acción de GAs es más intensa sobre el crecimiento (Fabian et al. 2000).
A nivel de la movilización de reservas en semillas al inicio del proceso de germina- ción. GAs endógenas o exógenas, aplicados en embriones en proceso de germinación, cau- san la producción de α-amilasas y otras enzimas hidrolíticas en las células de la capa de aleurona dispuesta por debajo de la cubierta seminal, encima del endosperma y embrión contiguo. Con ello se produce un proceso degradativo en las células del endosperma una
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vez que el almidón se desdobla en sus azúcares simples que serán usados como fuente de energía por las células del embrión, ahora en desarrollo. En esta fase, el embrión requiere de energía pues aún es heterótrofo y no puede obtener su energía vía fotosíntesis (obviamente al no haber desarrollado todavía su maquinaría capaz de captar y transformar energía lumínica). En el proceso se sabe también que la nueva α-amilasa es sólo sintetiza- da en presencia de GAs La secuencia de eventos conducentes por GAs desde la síntesis de α-amilasas en la capa de aleurona hasta su secreción al endosperma sería tentativamente la siguiente: GA proveniente del embrión es percibido primero por el receptor a nivel super- ficial iniciando señales como la activación de una proteína heterotrimérica G (Ueguchi- Tanaka 2000). Una señal de Ca+2^ provocaría que el “receptor-GA activado” se ligue a un represor DELLA, el cual a su vez será transportado al núcleo y degradado. Con esto se pue- de transcribir y procesar el gene GAMYB, un factor de transcripción que reconocerá y acti- vará promotores de genes de α-amilasas y otras enzimas hidrolíticas (Gubler et al. 2002, Ho et al. 2003). Estas son sintetizadas en el retículo endoplásmico, se acumulan en el Golgi (como vesículas) y luego son secretadas hacia el endosperma. En definitiva se asume que GAs, mediante proteólisis de los represores de señales transcripcionales DELLA, provocarí- an una de-represión, conducente a la transcripción de varios genes (Fu et al. 2002). Exis- ten varios reguladores negativos de las señales inducidas por GA del tipo DELLA; entre ellos SLN1, SLR1, D8 y RHT en gramíneas y RGA, GAI, RGL1, RGL2 y RGL3 en Arabidopsis. Cuando son degradados se advierten otros efectos típicos de la acción de GAs como por ejemplo en Arabidopsis , un patrón de desarrollo radial, la formación de meristema axilar y mantención del meristema terminal (Fleet & Sun 2005). La degradación de proteínas DELLA causada por GAs ocurre a través de la vía de ubiquitina-proteosoma. La señal GAs induce la fosforilación de las proteínas DELLA que es reconocida por una ubiquitin-ligasa y después de ser conjugada es degradada por el proteosoma 26S, mientras la ubiquitina es reciclada (Itoh et al. 2003).
Usos comerciales
Transición de fase juvenil a adulta. Aunque de carácter fisiológico, la aplicación de GAs puede afectar la condición juvenil, pasando ésta a la fase adulta y viceversa. Por ejemplo, una estaca o esqueje con características juveniles inicia la formación de raíces, siendo por ello apta para la multiplicación vegetativa, mientras que con el paso a la fase adulta, esta propiedad se pierde casi totalmente. Según el tipo de especie, la aplicación de GAs puede llevar estas condiciones en un tipo determinado de explante en uno u otro sentido. De esta manera, es posible además lograr acelerar la entrada a la floración en condiciones muy tempranas sin que la planta haya completado su fase juvenil. GA 4 junto con GA 7 son usadas en la práctica para inducir la floración temprana en Pinus sp., Taxus de 4 meses y Cupres- sus de 2 años, lo que significa una gran alternativa en programas de mejoramiento genéti- co a nivel forestal al contar de esta manera con ciclos reproductivos más cortos (Stuart & Cathey 1961).
Iniciación floral y determinación del sexo. Aplicaciones de GAs pueden reemplazar de- mandas específicas para florecer en plantas de día largo [PDL] (Gocal et al. 1999, King et al. 2003), por ejemplo, el requerimiento de un periodo de luz con más de 14 horas de luz o requerimientos de frío (semanas o meses a 5ºC). Sería posible entonces omitir alguna de las condicionantes al aplicar GAs, pero en ningún caso ambas simultáneamente o secuen- cialmente para obtener flores en estaciones del año en que no se han satisfecho los reque- rimientos ambientales específicos de la especie. GAs inducen además la formación de ele- mentos florales y adicionalmente pueden afectar la determinación sexual. GAs afectan los genes del tipo AGL20 , los cuales inducen a otros genes del tipo LEAFY. Estos últimos des- encadenan la acción de terceros como AP1 , que regulan la formación de sépalos; AP3 que afectan el desarrollo de pétalos y de estambres y de AG que regulan la conformación de carpelos. Ello determina que es posible modificar la estructura florar y conducir ésta a flo- res femeninas o masculinas (Yu et al. 2004). Lo anterior tiene importancia para el cruza-
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CITOCININAS
Síntesis, degradación y transporte
Las citocininas son hormonas esenciales en el accionar de varios procesos vinculados al crecimiento y desarrollo de las plantas y relacionados a la acción de varios genes. Se trata de derivados de la base adenina que en su posición N6 muestra varias substituciones, no teniendo la adenina sola, efecto hormonal alguno. El reconocimiento que citocininas pudie- sen corresponder a hormonas vegetales se inició con el descubrimiento de la kinetina en la época de los 50, siendo este un artefacto producto de la degradación del ADN en espermá- tidas de arenque sometidas al autoclavado (temperatura y presión). Su efecto hormonal fue visualizado rápidamente al inducirse, en compañía de auxina, diferentes tipos de morfo- génesis en tejidos de tabaco y de otras especies bajo condiciones in vitro. Un alto nivel de citocinina vs. auxina provocaba la formación de brotes en tejidos derivados de explantes de médula, mientras que con niveles bajos de citocininas y/o conjuntamente niveles altos de auxina, se observaba la formación de masas celulares no organizadas (callos) y la forma- ción de raíces con gradientes mayores de auxina (Skoog & Miller 1965). Posteriormente se descubrió la existencia natural de citocininas en diferentes especies (como también en pro- cariontes) siendo la zeatina, inicialmente hallada en semillas de maíz ( Zea mays ) la más frecuente y abundante, junto a su ribósido (Letham 1973). Junto a la zeatina se detectaron otros compuestos de acción semejante en el endosperma líquido de coco o “agua de co- co” (Caplin & Steward 1948).
Según su origen se pueden distinguir dos tipos de citocininas: aquellas naturales generadas por las plantas y otras artificiales, sintetizadas por el hombre. Todas las citocininas natura- les se generan a partir de DMAPP (vía del ácido mevalónico, Fig. 3) y 5’-AMP (Fig. 6) y su síntesis acontece principalmente en la raíz, aunque también en el meristema apical y en semillas inmaduras (Kakimoto 2003a). La mayoría de las citocininas naturales y artificiales conservan la base adenina, aunque a las segundas se les ha ligado diversas moléculas, ge- nerándose así, por ejemplo, la benciladenina (BA) o la furfurilaminopurina (kinetina). Pos- teriormente fue sintetizado otro tipo totalmente diferente de estructura, sin la base adeni- na, con acción biológica idéntica a las citocininas como el tidiazurón (TDZ) (Fig. 7). Los re- guladores sintéticos como BA, kinetina o TDZ, son más potentes que las hormonas natura- les endógenas (zeatina, trans -zeatina o isopentiladenina), debido no sólo a sus particulari- dades específicas, sino también a que, salvo algunos reportes contrarios, las artificiales no pueden ser degradadas o metabolizadas por el tejido. TDZ es considerado uno de los induc- tores más potentes en la formación de nuevos brotes o embriones somáticos tanto en plan- tas leñosas como herbáceas (Huetteman & Preece 1993).
Adicionalmente, las citocininas naturales pueden existir como hormonas activas con la base de adenina libre o como formas conjugadas con azúcares, como la ribosa o ribosa 5- fosfato enlazadas al N9 de la base adenina (Fig. 6). En estos casos, las citocininas conjuga- das muestran pérdida de actividad en ensayos biológicos.
Las citocininas se localizan en ambos sistemas conductores, floema y xilema y su presencia se considera como una posible señal vinculada con un déficit de nutrientes en el suelo. Ex- perimentos con injerto de plantas, han tratado de demostrar el transporte de estas hormo- nas desde la raíz hacia las partes aéreas, aunque esta movilización ascendente aún no pa- rece estar muy bien establecida. En cuanto a su degradación, las citocininas pueden ser inactivadas por O- glicosilación en el grupo hidroxilo terminal en citocininas tipo zeatina o por N- glicosidación en el N3 o N7 de la adenina. El primer efecto es reversible, considerán- dose esta forma como de reserva o almacenamiento. Además, las formas activas pueden ser degradadas por la acción de citocinin-oxidasas que reconvierten a varias en su base adenina o sus derivados.
20 AUXINAS, GIBERELINAS Y CITOCININAS v
Efectos fisiológicos
Promueven la división celular. La aplicación de citocininas estimula la progresión del ci- clo celular. En primer lugar, a nivel de la fase G1, citocininas más otras hormonas (auxinas) inducen la acumulación de ciclinas y por tanto promueven un nuevo ciclo celular (Smith & Atkins 2002). Citocininas también estimularían la entrada a la fase M, probablemente por activación de una fosfatasa.
Provocan la iniciación de brotes, organogénesis y androgénesis. Las citocininas cau-
Fig. 6. Rutas de biosíntesis de citocininas a partir de DAMPP y 5’-AMP. Las reacciones muestran la defosforilación de los intermediarios nucleótidos y la formación de bases libres derivadas de adenina.
