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Análisis de Enzimas: Producción de Amilasa, Lipasa, Proteasa y Ureasa en Microorganismos, Apuntes de Biología

Universidad Popular del CesarBiología

El proceso para determinar la capacidad de producción de enzimas, específicamente amilasa, lipasa, proteasa y ureasa, en diferentes microorganismos. El documento incluye objetivos, materiales y equipos, procedimiento y resultados de las pruebas. Las pruebas se realizan mediante métodos diferentes, como el método del almidón (0,2%) en medio sólido para la determinación de amilasa, el método con la yema de huevo y el método con el detergente tween 80 para la determinación de lipasa, el método de hidrólisis de la gelatina para la determinación de proteasa y el método de urea de rustigian y stuart para la determinación de ureasa.

Qué aprenderás

  • ¿Cómo se determina la capacidad de producción de amilasa en un microorganismo?
  • ¿Cómo se identifica la actividad proteolítica en un microorganismo?
  • ¿Cómo se detecta la presencia de lipasa en un microorganismo?

Tipo: Apuntes

2020/2021

Subido el 03/12/2022

walter-leonardo-duran-ibarra
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DETERMINACIÓN DE ENZIMAS
Universidad Popular del Cesar
Programa Microbiología
Laboratorio de Microbiología Ambiental
Docente: Sandra Rodríguez
Esta capacidad de producción de enzimas por parte de bacterias, hongos,
microalgas y de otros microorganismos heterotróficos, puede ser utilizada
como herramienta para inducir una mayor eficiencia en la degradación de
materia orgánica existente en aguas residuales. Las enzimas extracelulares o
ectoenzimas que están unidas a la superficie de la célula y las de forma libre
como las Exoenzimas son absorbidas dentro de las sustancias poliméricas
extracelulares (EPS) de la matriz del lodo del tratamiento de aguas residuales
(Cadoret et al., 2002); las hidrolasas son importantes especialmente para la
velocidad de la hidrólisis de la digestión anaerobia Figura 1. La presencia de las
Exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa en cada
microorganismo será evaluada tanto en medio líquido y sólido organotrófico.
Figura 1 . Mecanismo de acción: enzimas hidrolíticas sobre la materia orgánica. (1) Limitación de la transferencia de masa,
(2) EPS, (3) Intermediarios metabólicos, ( 4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH y Temperatura. Todos tienen un
efecto sobre la actividad de las enzimas involucradas en el tratamiento de aguas residuales (Burgess y Pletschke, 2008).
OBJETIVOS
Conocer el fundamento de las enzimas
Determinar la capacidad del microorganismo para producir la enzima
como amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa.
MATERIALES Y EQUIPOS
Suspensión liquida de microorganismo (bacterias, hongo, microalga, etc)
Micropipetas de 100µL
Medio enzimático de almidón 0,2% (α-amilasa)
Medio enzimático de yema de huevo (Lipasa)
Medio enzimático de Tween 20 ó 80 ( esterasa)
Medio de Licuefación de la gelatina (Proteasa)
Medio enzimático de urea (ureasa)
Yodo o solución de lugol
Gradillas
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DETERMINACIÓN DE ENZIMAS

Universidad Popular del Cesar Programa Microbiología Laboratorio de Microbiología Ambiental Docente: Sandra Rodríguez Esta capacidad de producción de enzimas por parte de bacterias, hongos, microalgas y de otros microorganismos heterotróficos, puede ser utilizada como herramienta para inducir una mayor eficiencia en la degradación de materia orgánica existente en aguas residuales. Las enzimas extracelulares o ectoenzimas que están unidas a la superficie de la célula y las de forma libre como las Exoenzimas son absorbidas dentro de las sustancias poliméricas extracelulares (EPS) de la matriz del lodo del tratamiento de aguas residuales (Cadoret et al ., 2002); las hidrolasas son importantes especialmente para la velocidad de la hidrólisis de la digestión anaerobia Figura 1. La presencia de las Exoenzimas: amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa en cada microorganismo será evaluada tanto en medio líquido y sólido organotrófico. Figura 1. Mecanismo de acción: enzimas hidrolíticas sobre la materia orgánica. (1) Limitación de la transferencia de masa, (2) EPS, (3) Intermediarios metabólicos, (4) Condiciones del aceptor de electrones, (5) pH y Temperatura. Todos tienen un efecto sobre la actividad de las enzimas involucradas en el tratamiento de aguas residuales (Burgess y Pletschke, 2008). OBJETIVOS  Conocer el fundamento de las enzimas  Determinar la capacidad del microorganismo para producir la enzima como amilasa, lipasa, proteasa, fosfatasa, celulasa y ureasa. MATERIALES Y EQUIPOS  Suspensión liquida de microorganismo (bacterias, hongo, microalga, etc)  Micropipetas de 100μL  Medio enzimático de almidón 0,2% (α-amilasa)  Medio enzimático de yema de huevo (Lipasa)  Medio enzimático de Tween 20 ó 80 ( esterasa)  Medio de Licuefación de la gelatina (Proteasa)  Medio enzimático de urea (ureasa)  Yodo o solución de lugol  Gradillas

PROCEDIMIENTO

Determinación de Amilasa Método del almidón (0,2%) en medio sólido: Sobre las placas de agar-almidón se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm de diámetro y removiendo el agar por succión y después se inocularon las cepas a examinar, hasta un total de 4 o 6 pozos por placa máximo. Estas fueron incubadas a 30- 35°C durante 48 horas y hasta 5 días en los casos dudosos. Tras la incubación se inundan las placas con una solución alcohólica de iodo al 2%. La hidrolisis del almidón se manifiesta por la aparición de un halo claro alrededor del pozo de crecimiento, en tanto que el resto de la placa se tiñe de color azul oscuro. Se considera que la actividad amilolítica es mayor cuanto más amplia es la zona clara (Mc-Faddin, 2004; Aguilar et al., 2000; Moronta, 2001). Determinación de Lipasa Método con la yema de Huevo: Para la preparación de la emulsión de yema de huevo se limpiaron y sumergieron los huevos de gallina en etanol al 95% durante una hora. De manera aséptica, se separó la yema de huevo, y con una pipeta estéril se agregó a 500mL de agar base, hasta luego obtener un homogeneizado de la suspensión. El medio de cultivo seleccionado fue el Agar-Agar 15g/L, y después de la esterilización, se agregó la suspensión de yema de huevo estéril a 500mL al medio sólido fundido estéril con agitación constante con un vortex y se enfrió a 55-60ºC. Luego de solidificarse el gel, se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm de diámetro y removiendo el agar por succión. Para evaluar la presencia de lipasa se adicionaron alícuotas de las muestras de microorganismos a un volumen de 0,5mL dentro de los pozos, cada microorganismo se sembró por separado y se incubó a 25ºC ó y a 37°C en oscuridad durante 5 días (Mc-Faddin, 2004). La reacción es Positiva (+); si se observa la presencia de una zona opaca en el medio alrededor del crecimiento, como producto de la precipitación de los ácidos grasos. Negativo (-) ningún cambio en el aspecto de las colonias o del medio de cultivo. Método con el detergente Tween 80: Para la detección de lipasa, se utilizó medio sólido con peptona (5,0g), NaCl (2,5g), CaCl.2H 2 O (0,05g), Agar-Agar (15g) y Tween 80 (5mL/L). Una vez preparadas las placas, se realizaron pozos usando varilla de vidrio estéril de 1cm de diámetro y removiendo el agar por succión. Se adicionaron las muestras de 0,5mL dentro de los pozos. La reacción es Positiva (+); si se observa la presencia de una zona clara alrededor del crecimiento, como producto de la precipitación de los ácidos grasos. Negativo (-) ningún cambio en el aspecto de las colonias o del medio de cultivo (Pratt et al., 2000; Mc-Faddin, 2004). Determinación de Proteasa Para la proteasa se aplicaron dos métodos con el objeto de identificar las enzimas de tipo proteolítico (gelatinasas) que licuan/hidrolizan la gelatina (Método cualitativo). Método de hidrólisis de la gelatina: Se utilizaron tubos conteniendo gelatina (caldo nutritivo a 4,0mM de medio algal + gelatina 10-20%) en forma de taco y sembrados por punción con el inóculo de cada microorganismo. Tanto los

Vol. 68, No. 12. University of Rochester School of Medicine and Dentistry, Rochester, New York.  Pratt Joel, Cooley J. Danny, Purdy Charles W. and Straus David C. 2000. Lipase activity from strains of Pasteurella multocida. Current Microbiology Vol. 40. pp. 306-