A. Análisis Fitoquímico. Cuantificación de monoterpenos presentes en la flor de
cempasúchil por HPLC
• Condiciones
1. Columna: Usar una columna C18 (250 mm x 4.6 mm, 5 µm).
2. Fase móvil: Emplear una gradiente de agua con ácido acético o trifluoroacético (0.1%) y
acetonitrilo.
3. Flujo: Ajustar el flujo a 1 ml/min.
4. Detector: Utilizar un detector de arreglo de diodos (DAD) para la detección de compuestos
a múltiples longitudes de onda (generalmente entre 190-400 nm).
• Preparar la muestra
1. Disolver 1 ml del concentrado en una mezcla de agua y metanol (fase móvil).
2. Filtrar la solución a través de un filtro de membrana de 0.45 µm para eliminar partículas.
• HPLC
1. Inyectar 20 µl de la muestra en el sistema HPLC.
2. Registrar los tiempos de retención y las áreas de los picos obtenidos.
3. Comparar los tiempos de retención con estándares conocidos para identificar los
compuestos.
4. Cuantificar los compuestos utilizando curvas de calibración de estándares conocidos.
B. Análisis IN VITRO del compuesto extraído
• Selección de líneas celulares
1. Células Pancreáticas: Usar líneas celulares como INS-1 o MIN6 para estudiar la secreción
de insulina.
2. Células Hepáticas: Utilizar células HepG2 para evaluar la captación de glucosa y la
gluconeogénesis.
• Cultivo Celular
1. Cultivar las células en un medio adecuado DMEM con g lucosa alta, FBS y antibióticos en
condiciones estériles.
2. Incubar a 37°C con 5% de CO2 durante 48 hrs.
• Tratamiento
1. Disolver el compuesto extraído en DMSO y preparar soluciones madre.
2. Diluir las soluciones madre en el medio de cultivo a 1:50.
3. Sembrar las células en placas de cultivo de 24 pozos y permitir que se adhieran durante 24
horas.
4. Tratar las células con diferentes concentraciones del compuesto por 48 hrs.
• Ensayo de secreción de insulina
1. Recolectar el medio de cultivo y medir la cantidad de insulina secretada utilizando un
ensayo ELISA específico para insulina.
2. Comparar los niveles de insulina secretada entre células tratadas y no tratadas (control).
• Análisis de Expresión Génica
1. Extraer ARN de las células tratadas y no tratadas.
2. Sintetizar ADNc mediante transcripción inversa.
3. Realizar PCR en tiempo real para cuantificar la expresión de genes GLUT4, IRS1, PDX1.
• Análisis de Expresión Proteica:
1. Lisar las células y obtener proteínas totales.
2. Realizar Western Blot para detectar proteínas clave en la señalización de la insulina y la
captación de glucosa.
3. Utilizar el anticuerpo p-AKT para detectar proteínas.
